张晓田，金 李，李慧贤，杨世峰，牛 丹，路万虹

肾脏损害是慢性乙肝病毒(HBV)感染最常见的并发症之一，主要表现为乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg)在肾小球、肾小管及肾小动脉血管壁沉积，同时伴随肾脏炎症、系膜增生及肾功能损害等病理征象[1]。我国慢性HBV感染人群约有1亿人，HBV感染及其并发症的防治对提高国民生活和医疗水平至关重要，是一个亟待解决的现实问题[2]。目前HBV感染肾损害的病理机制尚未完全明确，细胞自噬是真核细胞利用溶酶体降解受损细胞器和大分子蛋白质，并将其重新纳入能量循环的过程。在感染性或炎性疾病中，细胞自噬是一把双刃剑，适度的自噬对于维持细胞内环境稳定至关重要，过度自噬则可能引起更严重的细胞死亡和组织损伤[3-4]。本研究设计体外干预实验，观察HBV感染过程中Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路与肾小管上皮细胞自噬的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验细胞 人肾小管上皮细胞系HK-2，购自上海名劲生物科技有限公司。

1.2实验试剂 TLR4激动剂LPS-PG(上海康朗生物科技有限公司，tlrl-ppglps)，TLR4抑制剂TAK-242(杭州联科生物，2A-13871-5)；RPMI 1640 培养基(上海浩然生物技术有限公司，12633-012)；胎牛血清(上海浩然生物技术有限公司，16000044)；DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，DA1010)；CCK-8试剂盒(北京碧云天，C0038)；细胞核蛋白与浆蛋白抽泣试剂盒(北京碧云天，P0027)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天，P0010S)；TLR4、NF-κB、p62、LC-3B、Beclin-1 及β-actin抗体均购自Abcam官网。

1.3实验仪器 无菌操作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司，JB-CJ-1000FX )，细胞培养箱(上海跃进，WJ-3-160q)，低温高速离心机(德国Eppendorf，Eppendorf 5427 R)，倒置显微镜(德国Olympus，CKX53 )，恒温振荡器(上海启步生物科技有限公司，BSW-211C)，垂直电泳及电转印装置及其配套耗材(均为美国伯乐原装，型号Mini-PROTEAN Tetra)，电动匀浆器(美国Kimble，749521-1500)。

1.4细胞培养和干预方法 将人肾小管上皮细胞系HK-2细胞接种于培养瓶进行培养和传代，采用RPMI 1640 培养基+10%的胎牛血清，培养条件为37℃，5%CO2，当细胞生长至融合至80%左右进行传代。取2代细胞接种于96孔板继续培养，设置空白组、HBV感染组、TLR4激动剂组和TLR4抑制剂组。空白组仅培养2代HK-2细胞；HBV感染组加入HBV感染的人血清，所用血清均分离于本科室接收的慢性HBV感染患者；TLR4激动剂组同时加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的LPS-PG；TLR4抑制剂组同时加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的TAK-242。37℃，5%CO2，培养7 d，绘制细胞生长曲线，并采用CCK-8试剂盒测定HBV感染组、TLR4激动剂组和TLR4抑制剂组的细胞毒性活力。

1.5TLR4信号通路测定方法 细胞培养7 d后进行爬片，采用24孔板和配套的细胞爬片专用玻片进行操作，使用前玻片泡酸过夜，清洗，高压消毒和烤干。胰酶消化细胞重悬于1640培养基，调整细胞浓度为1×105；24孔板中先放入盖玻片，再接种细胞，培养48 h，丙酮固定并取出；取出后的盖玻片可直接盖于载玻片上，50%甘油封片后即可进行免疫组化实验。滴加0.3%的过氧化氢(H2O2)孵育30 min，清除内源性H2O2酶活性，PBS清洗5 min×3次，0.5%的Triton X-100孵育20 min，以增加细胞通透性，起到破膜和暴露抗原的目的。一抗孵育，4℃过夜，TLR4与NF-κB的抗体浓度均为1∶500，PBS清洗5 min×3次；二抗孵育，37℃孵育40 min。DAB试剂盒显色，梯度乙醇脱水之后，封片镜检。并采用图像分析软件ImagePro Plus 分析阳性表达强度。

1.6细胞自噬测定方法 细胞培养7 d后，弃去培养液，PBS冲洗细胞，并采用蛋白质抽提试剂盒提取总蛋白，进行免疫蛋白印迹(WB)实验。组装电泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液，以每个电泳通道10 μg的蛋白量进行电泳，先以60 V电泳30 min以清除凝胶内杂质，再调至90 V电泳1 h，此时蛋白按照分子量大小依次分割为不同的条带。组装电转印装置，配置转印缓冲液，以80 V电转印30 min，丽春红染液观察转印效果。条带笔直清晰者进行封闭与抗体孵育，封闭液和抗体稀释液均以脱脂牛奶配置，封闭液浓度为5%，抗体稀释液为3%，β-actin、Beclin-1、p62和LC-3B的一抗浓度均为1∶2000，4℃孵育过夜；二抗的浓度分别为1∶2000、1∶1500、1∶2000和1∶1800，37℃孵育90 min。抗体孵育完毕，PBST液清洗，ECL荧光显色，暗室显影，拍照，采用图像分析软件Image J分析灰度值。

2 结果

2.1细胞生长曲线与毒力活性 各组细胞生长曲线大致呈双S型，符合细胞生长一般规律。对照组生长速率最快，HBV感染组明显变慢，TLR4激动剂组最慢，TLR4抑制剂组位于HBV感染组和对照组之间。经CCK-8实验测得，TLR4激动剂组细胞毒性活力高于HBV感染组和TLR4抑制剂组，且HBV感染组高于TLR4抑制剂组(P<0.05)。见图1。

图1 各组肾小管上皮细胞的生长曲线

2.2TLR4信号通路表达水平 HBV感染组、TLR4激动剂组和TLR4抑制剂组TLR4与NF-κB表达水平均高于对照组(P<0.05)。TLR4激动剂组TLR4与NF-κB表达水平高于HBV感染组，TLR4抑制剂组低于HBV感染组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肾小管上皮细胞TLR4信号通路表达水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与HBV感染组比较，cP<0.05；与TLR4激动剂组比较，eP<0.05

2.3细胞自噬表达水平 HBV感染组、TLR4激动剂组、TLR4抑制剂组Beclin-1和LC-3B表达水平均高于对照组，P62表达水平均低于对照组(P<0.05)。与HBV感染组比较，TLR4激动剂组Beclin-1 和LC-3B表达水平升高，P62表达水平降低(P<0.05)；TLR4抑制剂组Beclin-1和LC-3B表达水平均降低，P62表达水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组肾小管上皮细胞TLR4信号通路表达水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与HBV感染组比较，cP<0.05；与TLR4激动剂组比较，eP<0.05

3 讨论

肾损伤是HBV感染的最常见并发症之一，近几年来，细胞自噬是其病理机制的研究热点[5-6]。细胞自噬是指细胞通过溶酶体系统降解受损细胞器和长半衰期蛋白的过程，能被饥饿、创伤应激、病原菌入侵等激活，其目的在于及时清理细胞内杂质，并分解供能，以在恶性环境中维持细胞内环境的稳定。TLRs是机体内的非特异性免疫分子，能快速识别突破机体物理屏障的病原微生物；TLRs还是非特异性免疫和获得性免疫的桥梁，在识别病原微生物后，能够通过免疫介质及其信号通路激活细胞免疫[7-8]。TLR4是目前已发现最特殊的TLRs，可识别革兰氏阳性菌脂多糖及病毒的病原相关分子模式(PAMPs)，因此TLR4及其相关信号通路对细菌与病毒均有免疫调控活性[9]。在心脑血管疾病的基础与临床研究中，杨会如等[10]证实启动TLR4/NF-κB通路能够激活自噬信号，对抗缺血缺氧性损伤。HBV感染致肾损伤中也有自噬信号异常激活，但是否与TLR4/NF-κB通路有关尚不明确。

本研究采用HBV感染患者的血清感染人肾小管上皮细胞系HK-2细胞，并进行体外培养和TLR4靶向干预实验，以分析TLR4/NF-κB通路对自噬是否有调控作用。从细胞生长曲线来看，HBV感染后HK-2细胞的生长速率明显减慢，这主要是因为病毒感染引起了细胞死亡。文献报道[11]，在HBV感染后，肝脏病理组织同时存在凋亡小体和自噬小体，两者共同参与了HBV感染的病理进程。本研究结果显示，TLR4激动剂组细胞生长速率进一步减慢，TLR4抑制剂组的细胞生长速率有所升高，说明抑制TLR4信号对于缓解HBV感染引发的细胞死亡有缓解作用。在所有TLR4相关信号中，TLR4/NF-κB通路是桥接病原微生物免疫、炎性损伤及局部组织坏死的关键通路[12]，因此本研究选择这两个关键介质展开分析，结果证实HBV感染后TLR4/NF-κB信号通路被激活，TLR4和NF-κB表达水平同时上调。

本研究对各组细胞的Beclin-1、LC-3B和P62表达均做了测定，三者在自噬生理病理中具有不同的意义：Beclin-1是细胞自噬的“守门人”，主要介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡的过程，以此调节自噬体膜合成和物质转运，是自噬小体形成与成熟的必需物质[13-14]。LC-3B具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，静息状态下以前者为主要存在形式，定位于胞质，当自噬流被激活后，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ并移位于胞膜，同时由于LC3-Ⅱ的分子量较LC3-Ⅰ有所降低，WB实验可同时看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两条条带，因此多数研究以WB实验测定LC-3B的表达水平，并以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ作为衡量自噬强度的重要指标[15-16]。真核细胞主要存在两种蛋白降解系统，泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统，p62是SQSTM1基因编码的泛素结合蛋白，也称为SQSTM1蛋白，在细胞自噬和细胞凋亡中均介导重要机制。文献报道[17]，无论自噬上游还是下游信号被阻断，都会导致P62聚集，P62表达与自噬强度呈负相关性。本研究发现HBV感染组的Beclin-1 和LC-3B表达水平升高，P62表达水平降低，说明HBV感染激活了肾小管上皮细胞的自噬，这可能是一种自我保护机制。进一步研究发现，激活TLR4/NF-κB信号通路后自噬水平加强，而抑制TLR4/NF-κB信号通路后自噬水平有所减弱，证实通过靶向干预TLR4能够调控HBV感染肾小管上皮细胞的自噬。

综上所述，本研究证实TLR4信号通路在肾小管上皮细胞HBV感染过程中可能参与了细胞自噬的调节作用，可能是其病理机制的重要组成部分，具有深入研究的价值。