肖 敏，乐志艳

(抚州市食品药品检验所质控科，江西 抚州 344000)

胃酸相关性疾病是一类胃酸与发病机理密切相关的上消化道疾病，主要包括反流性食管炎、胃肠道溃疡、胃炎、消化不良、十二指肠溃疡、卓-艾综合征、肠道十二指肠炎及非甾体抗炎药引发的消化道疾病等，在发达国家较为常见。该病是临床上最常见多发的消化系统疾病之一，严重影响了患者的生活质量[1-5]。因此，抑酸强度更高、抑酸持续时间更长的抗胃酸药的开发成了当务之急[6]。富马酸沃诺拉赞是由日本武田制药研发的钾离子(K+)竞争性酸阻滞剂((potassium competitive acid blocker，P-CAB)的新型可逆性质子泵抑制剂，药物原型发挥作用起效迅速，且半衰期长，抑酸作用显著，能够在胃壁细胞胃酸分泌的最后一步通过抑制K+对H+-K+-ATP酶(质子泵)的结合作用，提前终止胃酸的分泌，具有强劲、持久的抑制胃酸分泌作用，对糜烂性食管炎、胃溃疡、十二指肠溃疡及幽门螺杆菌感染等胃酸相关性疾病疗效良好[6-12]。该药具有全新的靶点，对质子泵的抑制作用无需酸的激活，以高浓度进入胃中，首次给药便能产生最大的抑制效应，且可持续24 h。该药在酸中稳定，药效及起效剂量在不同患者中的差异并不显著，疗效和安全性良好[13-14]。基于以上特点及优点，富马酸沃诺拉赞有望成为新的治疗药物，以解决当前酸相关疾病治疗中存在的问题，市场前景十分良好。富马酸沃诺拉赞的质量标准尚未被《中华人民共和国药典》收载[15]，本研究旨在通过高效液相色谱法分辨率和灵敏度高、分析速度快、重复性好及定量精度高等的特点，建立富马酸沃诺拉赞的含量测定方法，为今后该药的开发利用提供质量标准依据。

1 材料

1.1 仪器

2030C型液相色谱仪(配有四元泵、在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器及化学工作站，岛津公司)；CPA225D型电子天平[赛多利斯科学化学(北京)有限公司]。

1.2 药品与试剂

富马酸沃诺拉赞对照品(某医药科技有限公司，批号：150621，含量99.8%)；富马酸沃诺拉赞原料药(某医药科技有限公司，批号：150301、150715、150801、151012、161101及161102)；水为超纯水；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，2.5 μm)；流动相为0.01 mol/L磷酸钠溶液(取磷酸钠3.8 g，置于1 000 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用磷酸调节pH至6.8)-乙腈(V∶V=75∶25)；检测波长为230 nm；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μl；柱温为30 ℃。

2.2 系统适用性试验

精密称取富马酸沃诺拉赞对照品适量，加流动相超声溶解并稀释制成每1 ml约含0.2 mg的溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次。结果显示，富马酸峰的分离度为3.3，理论塔板数为3 750；沃诺拉赞峰的分离度为18.6，理论塔板数为8 994；连续进样精密度中富马酸的RSD为0.18%，沃诺拉赞的RSD为0.15%，能满足本品含量测定要求。因此，规定富马酸峰及沃诺拉赞峰与相邻的杂质峰分离度应符合要求，理论板数按沃诺拉赞峰计算不得<2 000，峰面积相对标准偏差均不得>2.0%。色谱图见图1。

2.3 专属性试验

本品在制备、贮存及使用过程中，不可避免地含有或产生少量杂质，为考察各种条件下杂质降解与主成分的分离情况，选择了强酸、强碱、强光、高温及强氧化剂条件进行试验。精密称取供试品约10 mg，置于50 ml容量瓶中，进行不同条件下的降解试验。(1)酸破坏：加1 mol/L盐酸溶液2 ml，破坏21 h，用碱中和。(2)碱破坏：加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，破坏21 h，用酸中和。(3)氧化破坏：加3%的过氧化氢溶液2 ml，室温(25 ℃)破坏20 h。(4)高温破坏：在100 ℃水浴条件下，放置9 h。(5)强光破坏：在光照强度为(4 500±500) lx的培养箱照射21.5 h。分别加流动相超声溶解并稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进样，用二极管阵列检测器扫描，得到色谱图，见图2。图谱显示，在强酸、强碱、氧化、高温及强光破坏条件下产生的降解物质与主峰的分离度均>1.5，空白溶剂无干扰，沃诺拉赞峰和富马酸纯度指数值均>0.995；表明各主峰均为单一物质峰，本法专属性良好，能满足含量测定要求。

A.对照品溶液；B.供试品溶液A. reference solution; B. test solution图1 富马酸沃诺拉赞的高效液相色谱图Fig 1 HPLC of vonoprazan fumarate

图2 专属性试验降解图Fig 2 Degradation map of specificity test

2.4 线性关系考察

精密称取富马酸沃诺拉赞对照品适量，加流动相超声使其溶解并稀释制成每1 ml约含0.8 mg的溶液，摇匀，得对照品储备液。精密量取上述溶液3、4、5、6及7 ml，分别置于20 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为121.06、161.41、201.77、242.12及282.48 μg/ml的系列对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程为：Y=16 019X-28 538，相关系数r=1.000 0。结果表明，富马酸沃诺拉赞在121.06～282.48 μg/ml范围内线性关系良好，能满足含量测定要求。

2.5 精密度试验

精密吸取同一富马酸沃诺拉赞对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果显示，富马酸沃诺拉赞峰面积RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取富马酸沃诺拉赞约20 mg，置于100 ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。同法配制6份，分别取上述溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，记录色谱图。结果显示，6份样品中富马酸沃诺拉赞平均含量为99.61%，RSD为0.22%(n=6)，本法重复性良好。参照重复性试验的测定方法，在相同的试验室由不同人员、不同的仪器及不同的时间进行试验，富马酸沃诺拉赞的含量为100.06%，RSD为0.52%(n=6)。将以上结果综合计算，表明本品含量测定方法由不同人员、在不同时间及不同台仪器上的含量测定结果为：富马酸沃诺拉赞的平均含量为99.83%，RSD为0.45%(n=12)，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已测含量的富马酸沃诺拉赞9份，每份约10 mg，分为3组，分别精密加入富马酸沃诺拉赞对照品8、10及12 mg，置于100 ml容量瓶中，均加流动相溶解并稀释至刻度。分别取上述溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，记录色谱图。结果表明富马酸沃诺拉赞的平均回收率为100.40%，RSD为0.79%，本方法回收率良好，结果见表1。

表1 富马酸沃诺拉赞的加样回收率试验结果(n=9)Tab 1 Recovery test of vonoprazan fumarate(n=9)

2.8 耐用性试验

根据《中华人民共和国药典：四部(2015年版)》通则9 101项下[16]的耐用性试验，考察本品测定结果不受影响的承受程度，为使本方法可用于常规检验提供依据。因此，本试验对流速、柱温、流动相的组成、流动相pH及色谱柱的改变进行耐用性试验考察。取“2.7”项下的供试品溶液，改变色谱条件进行试验。结果显示，改变色谱条件中流速、柱温、pH、流动相的比例及不同色谱柱进行含量测定，富马酸沃诺拉赞含量的检测结果无明显变化，表明了本方法的稳定性，见表2。

表2 耐用性试验供试品含量测定结果Tab 2 Sample content of durability test

2.9 样品含量的测定

取样品6批，按“2.1”项下色谱条件操作，测定富马酸沃诺拉赞的含量，结果见表3。

表3 富马酸沃诺拉赞含量测定结果Tab 3 Content determination of vonoprazan fumarate

3 讨论

在前期实验中，曾尝试采用C8、C18色谱柱，流动相采用水-乙腈(V∶V=19∶1)、甲醇-0.05%己烷磺酸钠溶液(用磷酸调节pH至2.5)(V∶V=50 ∶50)、磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L磷酸氢二钾，用磷酸调节pH至6.0)-乙腈(V∶V=70∶30)、0.01 mol/L磷酸钠溶液-乙腈(V∶V=75∶25)等条件组合。结果表明，在采用0.01 mol/L磷酸钠溶液-乙腈(V∶V=75∶25)为流动相、C18色谱柱的色谱条件时，富马酸沃诺拉赞色谱峰形最佳，重复性最好，峰纯度也能满足测定要求。

依据本品的特性，采用高效液相色谱法建立了含量测定方法，并对该测定方法进行了系统适用性、专属性、线性关系、重复性、中间精密度、溶液稳定性及方法耐用性试验等内容的验证。结果表明，本方法的线性关系良好，准确度高，精密度好，方法的耐用性良好。本方法测定结果准确、可靠，适用于富马酸沃诺拉赞含量的检测。