涂志兰，叶 敏，王志娥，金芃芃，王清华，叶 军，宿 映，杨化兰，李清华，肖伟忠，侯双兴#

(1.复旦大学附属浦东医院神经内科，上海 201399； 2.复旦大学附属浦东医院普外科，上海 201399； 3.复旦大学附属浦东医院老年医学科，上海 201399； 4.复旦大学附属浦东医院科创中心，上海 201399)

脑卒中是全球人口死亡和残疾的主要原因，其发病机制非常复杂[1]，而缺血性脑卒中为其最常见的类型，约占全部脑卒中的87%[2]。红景天苷是红景天根和根茎中的主要活性成分，具有抗疲劳、抗炎、抗自由基损伤、抗细胞凋亡及增强免疫功能等多种药理作用[3]。最新研究结果表明，红景天苷可改善内皮损伤，减轻动脉硬化程度，对急性脑缺血损伤具有显著的神经保护功能，而体外研究结果显示红景天具有很强的抗氧化活性[4-5]。但目前红景天苷对急性缺血性脑卒中神经保护作用的具体机制尚不清楚。热休克蛋白(HSP)是在高热、缺氧等应激条件下产生的一类应激反应性蛋白，其中与急性缺血性脑卒中关系最为密切的是HSP70，其在缺血缺氧应激后表达程度最高。本研究通过将红景天苷预处理后进行大鼠大脑动脉自体血栓栓塞，建立急性缺血性脑卒中模型，观察大鼠脑组织及动脉血HSP70表达量的变化，以探讨红景天苷预处理后HSP70在急性缺血性脑损伤中脑组织及脑微血管内皮细胞内表达量的差异。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠24只，体质量300～400 g，鼠龄12～13个月，雄性为主，由上海市浦东医院动物饲养中心提供。

1.2 试验用具

不同型号的PE管，长约4 cm，包括：内径×外径=1.0 mm×0.5 mm，内径×外径=0.50 mm×0.25 mm，内径×外径=0.61 mm×0.28 mm；22G宠物专用输液留置针；不同型号注射器(1 ml、5 ml)若干。

2 方法

2.1 分组

将SD大鼠24只随机分为对照组(C组)、自体血栓栓塞组(Z组)及自体血栓栓塞+红景天苷组(HZ组)，每组8只。

2.2 红景天苷预处理

红景天苷临用前以双蒸水溶解为5 g/L(平均1 ml中含红景天苷5 mg)。HZ组大鼠腹腔注射红景天苷24 mg/(kg·d)，连续注射6 d；C组、Z组大鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，连续注射6 d。第7日取Z组、HZ组大鼠制作大脑中动脉自体血栓栓塞模型。

2.3 大鼠大脑中动脉自体血栓栓塞模型的建立

(1)血栓制作过程：取Z组、HZ组大鼠，腹腔内注射0.4%戊巴比妥10 ml/kg，麻醉后将大鼠仰卧固定于手术台上，保持室内温度20～25 ℃。术中注意动物呼吸并保持呼吸道通畅，左侧颈正中切口，寻找颈总动脉，将颈总动脉近心端结扎，结扎线提起颈总动脉，将1 ml针筒的末端连接4 cm的PE管，用眼科剪将颈总动脉剪一小口，将1 ml针筒的末端连接4 cm的PE管(规格：内径*外径=1.0 mm*0.5 mm，北京西浓科技有限公司)导流出动脉血，使4 cm的PE管内充满动脉血(约0.2 ml)后结扎线上提阻断血液，将内有动脉血的PE管放置于40～60 ℃左右的水面上静置30～40 min，然后将导管内的血凝块用注射器缓缓移入0.9%氯化钠溶液中，清洗2～3遍去掉血栓表面的红细胞。(2)大鼠大脑中动脉栓塞模型的制作：用4 cm的PE管设计留置导管：将22G宠物专用输液留置针末端连接至总长4 cm的PE管(规格：内径×外径=0.50 mm×0.25 mm，北京西浓科技有限公司)上，PE管末端2 cm处进行标记，用该设计的留置导管吸取上述凝缩后约2 cm的血栓，在该颈总动脉开口前，后各放1根手术线，打活结，将该设计的留置导管在剪开的颈总动脉剪开的开口处插入，插入后1根结扎线系紧，寻找颈内动脉后，沿颈内动脉方向，利用眼科镊将该PE管缓慢轻推带有血栓的PE管至遇轻微阻力后阻塞大脑中动脉起始处，松开另1根结扎线，缓缓将PE管内的血栓注入大脑中动脉后将PE管缓慢推出后立即将开口处用结扎法扎紧，进行缝合，缝好后用酒精棉球消毒皮肤缝合处。术中及麻醉期间以小电热毯维持大鼠直肠温度36.5～37 ℃，注意观察大鼠呼吸及心率变化。建模成功表现为：大鼠左前肢持续屈曲，提尾实验阳性；侧推抵抗力减弱，转圈试验阳性。

2.4 建模2 h后操作

2.4.1 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积：Z组、HZ组大鼠按“2.3”项下方法栓塞2 h后处死大鼠，断头取脑后以视交叉为中心，取厚脑片2 mm，放入液氮中冷冻2 min后取出，放入2%的TTC溶液中，置于37 ℃温水浴30 min染色，正常组织染为红色，梗死组织呈白色。然后将脑片放入4%多聚甲醛中固定，1 d后测梗死体积以排除梗死组织不同程度水肿的影响。采用Image ProPlus 6.0图像分析软件测出各层梗死面积、总面积之和，计算公式为脑梗死体积比例=(各切面梗死面积之和)/(各切面面积之和)[6]。

2.4.2 检测HSP70蛋白的表达：Z组、HZ组大鼠建模2 h后留取动脉血，收集上清液，采用酶联免疫吸附法检测HSP70蛋白的表达。

2.4.3 脑组织及脑微血管内皮细胞HSP70的表达量：Z组、HZ组大鼠断头取脑后，取左侧脑组织，采用Western Blot法检测HSP70在脑组织中的表达。同时在左侧大脑皮层获取脑组织内微血管，收集脑组织微血管内皮细胞进行细胞分层，采用Western Blot法检测HSP70在血管内皮细胞中蛋白表达，提取大鼠脑组织总蛋白，计算蛋白含量。安装垂直电泳仪，配置10%的SDS分离胶及浓缩胶。取样本变性、冰浴，离心后上样。电泳后组装湿式转印夹层，恒压转移蛋白1.5 h，取出转印膜，根据标准蛋白条带定位目的基因，经5%脱脂牛奶封闭室温(25 ℃)1 h，一抗4度孵育过夜、二抗室温1 h孵育，显影观察，应用图像分析软件进行条带的灰度测定。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 三组大鼠TTC染色结果比较

与C组比较，Z组大鼠的脑梗死面积极明显增大，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；HZ组大鼠脑梗死体积明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)；而HZ组与Z组大鼠脑梗死体积的差异无统计学意义(P>0.05)，见图1—2。提示模型成功，红景天苷预处理对大鼠大脑中动脉自体血栓栓塞模型的脑缺血损伤有减轻作用。

图1 TTC染色结果Fig 1 Staining results of TTC

3.2 三组大鼠动脉血HSP70表达量比较

与C组比较，Z组大鼠动脉血HSP70表达量明显增多，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；而HZ组大鼠动脉血HSP70表达量极明显增多，差异有极显著统计学意义(P<0.000 1)；与Z组相比，HZ组大鼠动脉血HSP70表达量明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。表明Z组、HZ组大鼠不同程度的应激导致了动脉血HSP70表达量的增加。

图2 三组大鼠切面梗死面积与切面面积的比Fig 2 Ratio of the infarcted area to the cut area among three groups of rats

图3 三组大鼠动脉血HSP70表达量比较Fig 3 Comparison of HSP70 expression in arterial blood among three groups of rats

3.3 Western Blot法检测三组大鼠脑组织与脑微血管内皮细胞HSP70表达量变化情况

与Z组比较，HZ组大鼠自体血栓栓塞侧脑组织HSP70表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与C组比较，HZ组大鼠自体血栓栓塞侧脑微血管内皮细胞HSP70表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4—5。

图4 三组大鼠自体血栓栓塞侧脑组织HSP70表达量Fig 4 Expression of HSP70 in brain tissue of autologous thromboembolism among three groups of rats

图5 三组大鼠自体血栓栓塞侧脑微血管内皮细胞HSP70表达量Fig 5 Expression of HSP70 in lateral cerebral microvascular endothelial cells of autologous thromboembolismamong three groups of rats

4 讨论

文献报道，在高原上生存的生物中，有的依靠增加血红蛋白水平来适应低氧环境，还有的通过改善血红蛋白的结构和功能增加对氧的亲和度[7]。红景天素有“高原人参”之称，著名藏医经典《四部医典》中记载红景天药理作用广泛，其具有增强心脑耐缺氧、抗炎等的作用，还可抗疲劳、抗寒冷、提高免疫功能、抑制缺血再灌注损伤引起的脂质过氧化及清除自由基等[8]。研究结果提示，红景天苷可通过磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/缺氧诱导因子(PI3K/Akt/HIF)信号通路抑制炎症反应，减轻脑缺血性损伤；并可通过延长脑卒中的治疗时间窗而发挥神经保护作用；虽然目前红景天苷的神经保护作用已被广泛报道，但其具体作用机制、由何种相关蛋白参与及主要通过何种通路发挥作用尚不清楚[9]。

多项试验结果均提示，HSP70作为最重要的内源性热休克蛋白，在减轻应激损伤、维持细胞稳态、恢复细胞功能及减轻炎症反应等方面发挥着重要的作用[10-12]。研究结果显示，HSP70对神经细胞的凋亡及坏死有抑制作用[13]，但HSP70应激性表达增加能否拮抗神经细胞的氧化应激及其分子机制目前尚无直接的研究报道，如能发现诱导HSP70表达的化合物，其在临床治疗上将有广阔的应用前景。

前期研究中，通过对由高脂血症引起的兔颅内外不同脑动脉硬化的蛋白质组学分析发现，相同实验条件下，颅内动脉硬化程度比颅外动脉硬化程度轻[14]；通过对颅内外不同硬化动脉进行蛋白质组学分析，发现了8种差异蛋白表达，对其中的HSP70进一步分析发现，其在颅内动脉表达量高于颅外动脉，推测动脉硬化程度可能与HSP70的神经保护作用相关[15]，但未进行深入探讨。目前，西方医学尚无确切的治疗手段针对动脉粥样硬化的进展。一些中药制剂对延缓动脉粥样硬化性疾病的进展具有确切的疗效，但具体作用机制尚不明确。挖掘中药中具有诱导HSP70高表达的有效成分并阐明其分子作用机制，可为开发治疗脑缺血的新药提供理论基础[13]。本研究结果显示，与Z组比较，HZ组大鼠自体血栓栓塞侧脑组织HSP70表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与C组比较，HZ组大鼠自体血栓栓塞侧脑微血管内皮细胞HSP70表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；提示红景天苷可有效诱导HSP70的表达。

本研究首先检验了红景天苷预处理是否能增强缺血性脑卒中大鼠的耐受性，其次明确了HSP70在大鼠自体血栓栓塞模型中发挥的潜在角色，发现HSP70在预防缺血性脑卒中病情的进一步进展中能发挥关键性作用。TTC染色结果提示，与C组比较，Z组大鼠的脑梗死面积极明显增大，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；HZ组大鼠脑梗死体积明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)，模型成功；提示红景天苷预处理对大鼠大脑中动脉自体血栓栓塞模型的脑缺血损伤有减轻作用，与Han[16]的结果相似。而Han[16]的研究结果表明，大鼠经过红景天苷预处理可减轻脑缺血再灌注损伤，可能与降低血-脑脊液屏障通透性、减轻脑水肿及降低肿瘤坏死因子α的表达有关。但本研究结果提示，红景天苷预处理可使HSP70表达量增加，至于通过何种机制及通路发挥作用，还需进一步研究。