陈浩 张皓洁 师亮 李滢昊 任衍康 景玮 王燕宏 李新毅

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人多发的常见神经退行性疾病，以中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性丢失为主要特征，发病机制尚不明确，临床治疗以左旋多巴替代疗法为主，虽能改善患者症状，但并不能阻止疾病进展，长期应用还有诸多不良反应[1]，探寻新的治疗途径十分必要。众多研究显示氧化应激是DA能神经元选择性死亡的重要原因[2-3]。一些天然抗氧化剂如姜黄素、茶多酚被证明对PD有保护作用[4-5]。研究表明传统中药材枸杞具有抗氧化、延缓衰老等显著功效[6-7]，也常被用于治疗PD中药复方[8]，但单纯枸杞或枸杞提取物对PD的影响鲜见被报道。现代药理研究显示枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞的主要功效成分，能自由通过并调节血脑屏障[9]。本研究旨在观察LBP对帕金森病小鼠黑质DA能神经元的影响，并探讨其作用机制，以期为PD药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）购于 Sigma 公司，左旋多巴（L-DOPA）购于上海福达制药公司 （药准字H31022793），LBP购于上海康舟真菌多糖公司，兔抗小鼠TH多克隆抗体购于Abcam公司，SP超敏试剂盒购于福州迈新生物公司，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）试剂盒均购于南京建成生物公司。其余试剂为国产市售分析纯。

1.2 实验动物分组与处理健康雄性C57BL/6N小鼠 （山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK2002-0003）75 只，体重 18～22 g，8～12 周龄，随机分为5组，每组15只。①MPTP组：参照文献腹腔注射 MPTP（40 mg/kg），每日 1次，连续 7 d，制备PD小鼠动物模型[10]。②L-DOPA组：每天注射MPTP前3 h先灌胃给予一次L-DOPA（40 mg/kg），然后再进行MPTP注射，连续7 d。③LBP组：MPTP注射前3 d灌胃给予不同浓度LBP，每日1次，连续3 d；随后在每天注射MPTP前3 h先灌胃给予一次LBP，再进行MPTP注射，连续7 d。本研究选用两个LBP浓度处理动物：中剂量50 mg/kg和高剂量100 mg/kg，即LBP组分为两个浓度亚组。④Control组：腹腔注射等体积生理盐水。每次注射后2 h观察小鼠的行为表现，并于最后一次注射后进行爬杆实验。

1.3 爬杆实验采用宣武医院的方法[10]，在一根长50 cm、粗1 cm的垂直木杆顶端固定一软木塞，将小鼠轻置于木塞上，1 min后将木塞倒放，小鼠开始向上爬行，在3 s内爬行至木杆的一半者记3分，6 s者记2分，超过6 s者记1分。每只动物重复3次。

1.4 免疫组化染色爬杆实验完毕后，立即断头取脑，在冰面上小心分离中脑，一部分标本用于氧化应激指标检测；另一部分标本迅速投入4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，制作20 μm厚连续切片，切片经脱蜡水化和抗原修复后滴加兔抗小鼠TH多克隆抗体（1∶200），4℃过夜，PBS 冲洗，再依次滴加SP超敏试剂，室温2 h，DAB显色，脱水透明封片。镜下观察选取黑质范围内的切片，在同一背景光强度下进行显微摄影，依照图谱划定每张切片黑质的范围，采用IPP6.0图像分析软件统计TH阳性细胞数量。

1.5 氧化应激指标检测用匀浆器将采集到的中脑标本制成10%的组织匀浆，-80℃冻存。按照试剂盒使用说明，在Bradford法定量蛋白后，采用化学比色法检测组织标本中的 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.6 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，实验数据以±s表示，数据呈正态分布，采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验；方差不齐采用Dunnett's t检验。检验水准α=0.05。

2 实验结果

2.1 行为学评价MPTP组小鼠于第1次MPTP注射后2 h出现竖毛、间断震颤等表现；第4次MPTP注射后出现颤尾、频繁震颤和活动减少；最后1次MPTP注射后出现连续震颤、频繁吞咽、四肢僵硬和活动受限。经L-DOPA和LBP处理后，小鼠的行为学表现较MPTP组小鼠减轻，症状持续时间也缩短，尤以L-DOPA最为明显。Control组小鼠活动自如，未见上述症状。爬杆实验结果显示：与 MPTP 组（3.53±1.32）相比，Control组（7.61±1.53）、L-DOPA 组 （6.87±1.51）、50 mg/kg LBP 组（5.07±1.28）和 100 mg/kg LBP 组（5.20±1.37）四组小鼠得分均远高于MPTP组小鼠（P＜0.01）（图1），即爬完杆子全程所用时间较少，说明上述4组的肢体运动协调情况较好。两个LBP处理组爬杆得分差异无统计学意义，但都小于Control组和LDOPA 组（P＜0.05）（图 1），说明 L-DOPA 对 PD 行为症状改善优于LBP。

图1 爬杆实验结果 （n=15）。 1)与 MPTP组比较，P＜0.01；2)与Control组比较，P＜0.05； 3)与 L-DOPA 组比较，P＜0.05

2.2 黑质TH免疫组化染色结果Control组小鼠黑质可见大量TH阳性神经元，细胞密集分布，排列成数层，呈粗条带状（图2）；MPTP组小鼠黑质TH阳性神经元数量较对照组明显减少（340±31 vs.1204±112，P＜0.01），细胞稀疏分布，呈染色较浅的细条带 （图2）；L-DOPA组小鼠TH阳性细胞数量也较 Control组减少明显（295±63 vs.1204±112，P＜0.01），呈较 MPTP 组略短的浅细条带分布（图2），但统计学显示两组细胞数目差异无统计学意义（P＞0.05）。 在50 mg/kg LBP 组（655±78）与100 mg/kg LBP 组（704±38），TH 阳性神经元数量均较MPTP组或 L-DOPA组明显增多 （P＜0.01），呈染色较深的细条带分布，但仍少于对照组 （P＜0.01）（图2）；两个LBP组TH阳性细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠中脑氧化应激情况MPTP组小鼠中脑组织 SOD、GSH-Px和 CAT酶活力显著低于Control组，MDA含量则显著高于Control组（表1）（P＜0.01）；经 L-DOPA处理后，小鼠中脑SOD、GSH-Px和CAT酶活力反而较MPTP组进一步降低，MDA 含量则进一步升高（表 1）（P＜0.05）；经两种浓度LBP处理后，小鼠SOD、GSH-Px和CAT酶活力均较MPTP组或L-DOPA组有显著升高，MDA含量则均较MPTP组或L-DOPA组有显著下降（表 1）（P＜0.01）；100 mg/kg LBP 组小鼠 SOD、GSH-Px和CAT酶活力稍高于50mg/kg LBP组，MDA 含量则较其稍低（表 1）（P＜0.05）。

图2 黑质致密部TH免疫组化染色结果（n=9,±s）。1)与Contro组比较，P＜0.01； 2)与 lMPTP 组比较，P＜0.01；3)与 L-DOPA 组比较，P＜0.01

3 讨论

枸杞是一味药食两用的中药材，在我国已有两千多年的使用历史。LBP是枸杞的主要活性成分，近年来研究发现LBP除具有独特滋补作用外，还有神经保护作用[11]。用LBP处理大脑缺血-再灌注损伤模型，可显著降低神经功能缺损程度，减小模型动物脑梗死的面积[12]。LBP对视神经切断术后轴索变性也有缓解作用，能明显延缓中枢神经系统的继发变性[13]。针对阿尔兹海默病、老年痴呆症等神经退行性疾病研究发现，LBP一方面可减少淀粉样蛋白产生和抑制淀粉样肽蛋白酶活性，降低其诱导的蛋白激酶激活，减少神经细胞死亡；另一方面还可促进海马齿状回的神经发生，改善其学习记忆能力[14]。PD是发病率仅次于阿尔兹海默病的全球第二大神经系统退行性疾病，两种疾病有许多共性的病理机制[15]，且枸杞在中医治疗PD的方剂中也经常被使用，提示枸杞可能对PD有潜在的治疗价值。 有体外研究表明枸杞提取物可提高MPP+处理的线虫模型和PC12细胞存活率，对抗MPP+的神经毒性[16]。但目前未见有枸杞或枸杞提取物用于PD体内研究的文献报道。本研究制作MPTP帕金森病小鼠模型，首先观察了枸杞主要组分——LBP对PD小鼠行为学和病理学的影响。结果发现模型小鼠出现震颤麻痹等典型PD临床表现，肢体运动协调情况也较差，同时伴有黑质致密部DA能神经元的大量丢失，说明本研究复制的动物模型符合实验要求。经过L-DOPA处理后，PD小鼠的行为表现明显改观，肢体运动协调情况显著改善，但仍伴有黑质DA能神经元的大量减少，提示L-DOPA替代治疗虽然能改善患者的症状，但并不能阻止疾病的进程，与文献报道一致[1]。鉴于低浓度LBP对小鼠的保护作用较弱[9]，本研究直接选用中、高浓度LBP作用于模型小鼠。经过LBP处理后，小鼠的行为表现和肢体运动协调情况改善效果虽不如L-DOPA组显著，但黑质DA能神经元的丢失情况却有所缓解，提示LBP不但能改善PD小鼠行为症状，而且对中脑DA能神经元具有一定神经保护作用。此外，两个LBP浓度组小鼠间的行为表现和黑质TH阳性神经元数目并无显著差异，提示中等浓度枸杞多糖即可发挥神经保护相应。

表1 各组小鼠中脑氧化应激情况（±s）

表1 各组小鼠中脑氧化应激情况（±s）

1)与 Control组比较，P＜0.01；2)与 MPTP 组比较，P＜0.05；3)与 L-DOPA 组比较，P＜0.01；4)与 50 mg/kg LBP 组比较，P＜0.05

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虽然PD的发病机制尚未完全阐明，但大量研究表明线粒体功能障碍、炎症反应、细胞凋亡、自噬障碍、钙超载、铁代谢异常等多种机制均参与黑质DA能神经元丢失过程，而氧化应激是上述机制中共同存在的病理过程，被认为是PD发病的中心环节和核心因素[2-3,15]。多项临床研究已证实：PD患者脑内处于氧化应激状态[2]。神经递质DA能够自发氧化产生ROS自由基、苯醌等细胞毒性物质，在正常情况下被体内抗氧化系统清除；而在氧化应激时，蛋白水解酶活性降低，自由基清除能力减弱，过多的自由基不单会加速DA自氧化，还会造成细胞蛋白质、脂质或DNA等损伤，影响线粒体功能，导致更多自由基产生，进一步增强氧化反应。在机体防御体系中，SOD是清除自由基的第一道防线，可歧化O2-为O2和H2O2；H2O2则继续被CAT分解为 O2和 H2O；GSH-Px可特异催化 GSH对H2O2的还原，可直接反映机体清除自由基的能力；MDA是脂质过氧化反应后的产物，可间接反映机体抗氧化酶的功能[17]。本研究中，MPTP组小鼠在DA能神经元丢失的同时，伴有中脑组织SOD、GSH-Px和CAT活性较对照组显著降低和MDA含量显著升高，提示模型动物中脑抗氧化系统功能减弱，自由基增多，细胞正处于脂质过氧化阶段。经L-DOPA处理后，小鼠中脑组织SOD、GSH-Px和CAT含量较MPTP组还低；MDA含量则较其升高，提示L-DOPA组动物脑内处于比MPTP组还严重的氧化应激状态。这可能是因为L-DOPA在脑内代谢也产生ROS自由基，加重了脂质氧化和细胞损伤[18]。枸杞是具有优良抗自由基和抗氧化功效的传统中药，《神农本草经》和《本草纲目》记载其“名目安神，令人长寿”。针对衰老的研究发现，LBP可提高机体氧化酶的活力，增强清除自由基的能力，减缓脂质过氧化，延缓衰老[7]。本研究用LBP处理模型动物，发现其不但可以减少DA能神经元丢失，还可增强中脑SOD、GSH-Px和CAT活性和减少MDA含量。提示LBP对PD模型中脑的氧化应激也具有缓解作用，且中等剂量LBP对氧化状态的改善已十分明显；而打破氧化应激恶性循环是保护DA能神经元，避免其损伤丢失的必要途径[19]。

综上所述，L-DOPA作为PD治疗的一线用药，能够改善其行为症状，但同时会加重中脑氧化应激，造成DA能神经元进一步损伤；LBP通过清除自由基和抗氧化作用，能减少DA能神经元的损伤，对MPTP帕金森病小鼠起到神经保护效应，且中等剂量LBP效果就已十分显著。将L-DOPA和中等剂量LBP联合应用，可能一方面能够提高PD的临床疗效，另一方面改善L-DOPA治疗的不足。对此尚需进一步研究证实。