孙影 吴兴饶 许志峰 夏敏 孔庆霞

大脑中的炎症介质在癫痫发生以及随之而来的合并症、癫痫的神经病理学中起着病因学作用[1-2]。 而激活的星形胶质细胞（astrocytes，AST）具有吞噬功能，并能分泌多种炎性因子参与中枢神经炎症的发生[3]。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）能够透过血脑屏障[4]，发挥神经保护作用。在中枢神经系统中，星形胶质细胞是否存在粒细胞集落刺激因子受体（granulocyte colony-stimulating factor receptor,GCSFR），G-CSF能否通过激活AST上的 G-CSFR从而减轻癫痫导致的炎症反应都尚未明确。因此，我们通过以下实验对上述问题进行了验证。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型建立由山东鲁抗实验动物中心（生产许可证scxk鲁20140007)提供38只健康成年雄性C57BL／6小鼠，体重20～25 g，均为6～8周龄。动物使用已通过山东大学伦理委员会批准。

小鼠癫痫持续状态模型：C57BL／6小鼠称重后腹腔注射溴化甲基阿托品(1 mg／kg,Sigma),30 min后腹腔注射匹罗卡品(300 mg／kg,Sigma)。根据改良Racine评分[5]（对小鼠发作程度进行评估。将癫痫发作＞4级，且持续发作1 h的小鼠纳入癫痫持续状态模型组。小鼠癫痫持续状态(status epilepticus，SE)1 h 后，腹腔给予地西泮（7.5 mg／kg，上海旭东药业）终止发作。对照组小鼠给予等体积生理盐水腹腔注射。P+G组，待癫痫小鼠终止发作后给予 G-CSF（10 μg／kg，Novus ）皮下注射，每天注射1次，连续注射3 d。

分组：按照完全随机法将小鼠随机分成3组。A：对照组（Control组）：实验动物仅用等药物体积生理盐水注射，共8只。B：匹罗卡品处理组（P组）：实验动物腹腔注射匹罗卡品，共15只。C：匹罗卡品和G-CSF处理组（P+G组）：实验动物腹腔注射匹罗卡品后皮下注射G-CSF，共15只。

每组随机抽取经药物处理3 d的小鼠（每组4只），待10%水合氯醛麻醉后，使用生理盐水、4%多聚甲醛灌注，断头取脑。将脑组织置于4%的多聚甲醛中4℃过夜固定，后放入30%蔗糖中进行脱水，待脑组织沉底后行连续冠状冰冻切片，得10 μm脑切片，-80℃保存备用。其余小鼠在麻醉下断头取脑，分离出海马组织储存于液氮中，直到用于Western Blot分析。

1.2 免疫荧光染色每组随机抽取8张冰冻切片4℃复温，山羊血清（中山金桥）室温封闭。封闭后滴加抗 G-CSF 抗体（1∶1000 ，Abcam，兔单克隆抗体）和自带荧光的抗GFAP抗体（1∶1000，Abcam，小鼠单克隆抗体，红色）混合液。4℃避光孵育过夜。 依次滴加荧光二抗（1∶500，Abcam，驴抗兔，绿色），DAPI。抗荧光衰减剂封片后，放置于荧光显微镜下观察及图像采集。

1.3 尼氏染色随机抽取8张冰冻切片置于4℃冰箱中复温，依次放入60℃的0.5%甲苯胺蓝水溶液、70%酒精、100%乙醇和二甲苯溶液中。中性树胶封片，采用普通显微镜进行图像采集。

1.4 Western-Blot检测把冷冻的海马组织放入裂解缓冲液和PMSF（碧云天）混合液中，离心提取蛋白质。使用BCA蛋白质测定试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度。通过12%十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离海马组织裂解的蛋白质（30 μg/泳道，bio-tanon），并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h。后使用抗 IL-Iβ 抗体（1：1000，Santa Cruz，兔单克隆抗体）浸泡，4℃过夜。滴加二抗（山羊抗兔IgG；1：5000 稀释； Santa Cruz）室温孵育 2 h。 通过 ECL发光液（Millipore）使蛋白条带可见。检测抗GFAP抗体（1：1000，Abcam，兔单克隆抗体）、抗 IL-6β抗体（1：1000，Abclonal，兔单克隆抗体）、抗 G-CSF抗体（1：1000 ，Abcam，兔单克隆抗体）时除一抗不同，其余实验步骤相同。所有实验至少重复三次。使用imageJ软件，通过光密度法量化条带，并且以β-actin(1：100000，Abclonal)相对密度作为内参表达。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0进行统计学分析。计量数据以±s)表示，三组之间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。使用Graphpad Prism 6.0软件绘图。

2 结果

2.1 癫痫动物模型30只小鼠经匹罗卡品处理后，26只小鼠出现了SE，概率为86.67%；SE过程中死亡7只，SE后死亡2只。在造模成功并且存活的17只小鼠中，随机抽取9只为P+G组，进行皮下注射G-CSF，未出现死亡。对照组小鼠均未出现SE和自发性癫痫发作。

2.2 G-CSF在脑组织中的表达使用免疫荧光双染技术鉴定G-CSF在小鼠海马中的表达。镜下可见G-CSF绿色荧光呈阳性（图1-A1），GFAP为红色荧光（图1-A2），细胞核为蓝色荧光（图1-A3），叠加后可见G-CSF与GFAP细胞核完全重叠（图1-A4）。

图1 免疫荧光双染技术检测G-CSF（箭头所示）在AST中的表达情况（400×）

2.3 尼氏染色结果镜下：Control组（图2-C）可见排列整齐、紧密、形态规则的大量尼氏小体（Nissl body），神经元胞体呈多角形。P组（图 2-P）CA1区典型神经病理学改变，包括神经元结构异常或丢失，核缩小，尼氏小体散在分布、排列紊乱，尼氏小体阳性细胞计数较C组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。P+G 组（图 2-P+G）注射 G-CSF 后明显改善海马CA1区的组织结构，尼氏小体阳性细胞计数较P组有明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 尼氏染色。C为对照组，P为匹罗卡品组，P+G为经GCSF干预的匹罗卡品组。各组海马 CA1区神经元的表达（400×），差异有统计学意义（**P＜0.01）

2.4 Western BlotA图表示的是曝光条带，B图是根据曝光条带灰度分析后所做柱状图。可见P组 GFAP、IL-1β、IL-6的表达较 control组、P+G 组明显增高 （P＜0.05）；P组G-CSF表达明显高于control组 （P＜0.05）；P+G组 G-CSF表达高于 P组，在外源性G-CSF刺激下，海马神经元自分泌G-CSF 增加（P＜0.05 ）（见图 3）。

图 3 Western-Blot检测 GFAP、IL-1β、IL-6、G-CSF 在各组小鼠海马组织中的表达。C为对照组，P为匹罗卡品组，P+G为经G-CSF 干预的匹罗卡品组（*P＜0.05，**P＜0.01 ）

3 讨论

G-CSF与G-CSF-R广泛分布于在哺乳动物脑内[6]，可能通过其受体G-CSFR提高AKT的磷酸化，从内源性和外源性两个途径抑制氯化锂-匹罗卡品诱发癫痫后神经元细胞的凋亡[7]。同时，越来越多的证据证实了G-CSF在几种神经病理状态下的保护作用，包括抗凋亡、抗炎、刺激神经元生成等[8-9]。然而，尚未有研究调查G-CSF是否减弱TLE匹罗卡品模型至痫期SE诱发的AST异常增生和神经炎症反应等。

星形胶质细胞异常活化是癫痫的病理标志[10]，在所有癫痫动物模型中均能观察到与癫痫活动相关的脑区中AST的异常活化[11]。研究表明[12-13]在脑卒中动物模型中发现注射G-CSF后活化的AST减少，脑损害程度也同时减轻。我们的实验在脑组织免疫荧光双标实验中证明G-CSF在AST上大量表达。对TLE模型小鼠连续3天行皮下注射G-CSF治疗后，AST较TLE模型组较少。可以说明G-CSF具有降低AST异常增生的作用。

炎症是癫痫发作起始和维持的基本因素，促炎细胞因子如IL-1β和TNF-α等已被证明可增加神经元兴奋性和同步性，从而增加癫痫发作的几率[14]。在这种情况下，我们的实验证明G-CSF降低SE小鼠海马中促炎性细胞因子IL-1β和L-6的水平。同时，外源性G-CSF能够刺激海马神经元自分泌G-CSF，从而形成正反馈，进一步降低AST的异常增生和神经炎症反应。

综上所示，我们研究的G-CSF在癫痫小鼠星形胶质细胞中大量表达，并能降低脑组织中的炎症因子，提示G-CSF可能参与癫痫的保护作用。因此G-CSF可能成为癫痫治疗的潜在新药，但相关实验还在逐步完善，有待于我们进一步的研究。