郑倩男,冯长梅,吴 桐,周红兵,石松利,*

(1.包头医学院药学院,包头医学院蒙中药性物质与功能研究所,内蒙古包头 014060; 2.安徽省荣军医院,安徽怀远 233400; 3.内蒙古北方重工集团有限公司医院,内蒙古包头 014060)

高脂血症是体内脂类代谢紊乱导致血脂水平超过正常范围的一种疾病,多由于人们生活方式及饮食习惯导致[1]。肝脏是人体重要的代谢器官,承载脂类、糖、蛋白质代谢,过量摄入高脂食物,会造成脂肪积存肝细胞内,引起肝细胞肿大、脂肪浸润性炎症等肝损伤和功能异常[2],因此,如何通过饮食调节脂质代谢、改善肝损伤的发生引起人们的广泛关注。油脂作为人类三大营养物质之一,是必需氨基酸的来源和溶质性维生素的载体,其摄入量和脂肪酸构成对人体血脂水平的变化有很大影响[3]。大量研究表明植物油中的不饱和脂肪酸具有降血脂、预防脂肪肝等作用[4-6],也因此天然植物油成为降血脂和改善肝损伤的研究热点。

扁桃属植物约52～53个种,广泛分布于世界各地。扁桃仁中高含量的单不饱和脂肪酸对高脂血症患者的血脂和载脂蛋白水平有良好的调节作用[7],当扁桃作为食物,有助于维护健康的血脂水平[8]、提高抗氧化能力[9]和缓解肝损伤[10]。本实验组研究的是蒙古高原特有的阿拉善荒漠种——蒙古扁桃(Amygdalusmongolica),蒙名乌兰-布衣勒斯,隶属蔷薇科扁桃属,是具有地区特色的中蒙药资源[11-12]。蒙古扁桃以种仁入药,前期研究表明:蒙古扁桃种仁富含总黄酮、蛋白质、粗脂肪、酚类、黄酮、有机酸、多糖、α-维生素E等营养和药用成分[13-16];含油率量高达40%以上,其主要成分是以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸,理化性质优良[17];重金属含量较低,在急性毒理实验中尚未见明显的中毒症状[18];蒙古扁桃水煎液及其石油醚提取物具有调节血脂和增强抗氧化作用[19-21]。然而其对由高脂血症引起的肝脏损伤的机制尚不明确,通过饲喂高脂饲料诱导建立大鼠高脂血症模型,较系统的探讨了蒙古扁桃油对受试模型组的脏器系数、肝脏组织的脂质过氧化作用,并对肝脏病理切片进行观察,以期对蒙古扁桃油的保护肝脏作用提供实验依据,为更广泛利用蒙古扁桃油资源和开发新品种的植物油提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar大鼠 SPF级,雄性,体质量(90±20) g,由内蒙古大学实验中心提供,生产许可证书:SCXK(蒙)2002-0001,饲养条件:室温(25±2) ℃。相对湿度55%±2%。高脂饲料:基础饲料77.4%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇2%、猪胆盐0.5%、丙硫氧嘧啶0.1%;蒙古扁桃 蒙古扁桃采摘于内蒙古阿拉善雅布赖戈壁,经内蒙古科技大学包头医学院石松利教授鉴定为蔷薇科植物蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)的干燥成熟种子;总胆固醇(TC)试剂盒(批号:AUZ2732)、甘油三酯(TG)试剂盒(批号:AUZ1433)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(批号:AUZ2822)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(批号:AUZ2994) 美国贝克曼公司;丙二醛(MDA)试剂盒(批号:20150505)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号:20150506)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒(批号:20150503) 南京建成生物工程研究所。石油醚(分析纯) 天津市凯通化学试剂有限公司；特级初榨橄榄油 山东鲁花集团有限公司，基础饲料 北京科澳协力饲料有限公司；蛋黄粉(批号:20150310)、胆固醇(批号:20150309) 郑州龙晨食品添加剂有限公司；猪胆盐(批号:20150312) 北京奥博星生物技术有限责任公司；丙硫氧嘧啶片(批号:1402F09) 上海朝晖药业有限公司。

Trace DSQII气相色谱/质谱联用仪 美国Thermo Fisher;全自动脱帽离心机 GENIUS 5K-D 长沙鑫奥仪器;Olympus AU640全自动生化分析仪 日本奥林巴斯公司;LEICA RM2235 BiOTek酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;NP-T生物组织自动脱水机、NP-B型生物组织包埋机 孝感市诺普电子科技有限责任公司;荧光显微镜 ZEISS Microlmaging GmbH37081 Gottingen,X-Cite SERIES120激发器;照相机 AxioCamMR5。

1.2 实验方法

1.2.1 蒙古扁桃油制备 蒙古扁桃种子放入55 ℃的烘箱中8 h,去杂,去壳,取其种仁粉碎。采用索氏提取器提取蒙古扁桃油,加入一定比例的60～90 ℃石油醚,放置水浴锅中进行提取后,抽滤,浓缩至干,然后将浓缩的溶液放入105 ℃的烘箱中干燥2 h,冷却后放置4 ℃冰箱中冷藏,静置后取上清液,即为蒙古扁桃油,备用[22]。

1.2.2 蒙古扁桃的油脂肪酸成分分析 GC条件:TR-35MS色谱柱,进样口温度250 ℃,载气流量:1 mL/min,分流比为100∶1,程序升温,柱箱温度起始40 ℃,停留1 min,升温速度20 ℃/min,升温至280 ℃,停留3 min。MS条件:离子源EI,全扫描,扫描范围:1～600 amu[22]。

1.2.3 动物分组与模型建立 80只Wistar雄性大鼠,以基础饲料喂养一周以适应新的生存环境后,将大鼠随机分为8组(见表1),每组10只;除空白对照组和蒙古扁桃油对照组给予基础饲料,其他各组大鼠均供给高脂饲料,建立高脂血症大鼠模型,于5周后眼眶后静脉取血测定血脂水平,与空白对照组比较,高脂模型组、橄榄油对照组、蒙古扁桃油组(A:10、B:7.5、C:5、D:2.5 mL/kg)的TC和LDL-C显著升高说明高脂血症大鼠模型成功建立;从第6周开始进行灌胃,空白对照组、高脂模型组给予生理盐水,各组大鼠均按体质量供给实验样品(蒙古扁桃油、橄榄油),自由饮水。

1.2.4 动物血样本采集及指标测定 连续喂养大鼠5周,末次进食后禁食12 h,眼眶静脉丛采血2～3 mL,按照试剂盒方法进行操作,检测TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.2.5 动物肝脏样本采集及肝脏指数的计算 腹主动脉放血处死大鼠,观察其整体形态,取出肝脏组织,同时称量,肝脏指数按公式(1)计算。

式(1)

1.2.6 肝脏匀浆制备及指标测定 取肝脏组织块在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,以质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入0.9%生理盐水,冰水浴条件下,机械匀浆,制备10%的匀浆液,300 r/min离心10 min,取上清液,按照试剂盒方法进行操作,测肝组织MDA含量、SOD活性、GSH含量。

1.2.7 肝脏病理组织学检查 大鼠肝脏摘除后迅速放置4%多聚甲醛24 h后,在梯度酒精(75%、85%、95%、100%)和二甲苯中脱水与透明,浸蜡包埋后,制片(约7 μm厚),切片在二甲苯中脱蜡后,苏木精-伊红(HE)染色,脱水,中性树胶封片,显微镜下观察。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 19.0软件进行统计学处理,以x±s(平均值±标准差)表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性比较,p<0.05表示差异有统计学意义。

1.4 量效关系

将不同剂量的蒙古扁桃油组数据的均值导入Origin 8.5软件中拟合蒙古扁桃油的量效关系曲线。

2 结果与分析

2.1 蒙古扁桃油的脂肪成分分析

蒙古扁桃油中含有11种脂肪酸其种类多于含6种脂肪酸的橄榄油。蒙古扁桃油中不饱和脂肪酸占总量的76.66%,其中油酸占23.81%,亚油酸占47.11%。饱和脂肪酸以棕榈酸为主,SFA的含量为22.16%(见表2);橄榄油中不饱和脂肪酸占总量的80.19%,其中油酸占67.39%,亚油酸占12.0%。饱和脂肪酸以棕榈酸和硬脂酸为主,含量分别为10.56%、2.63%(见表2)。

表2 蒙古扁桃油中脂肪酸组成Table 2 Fatty acid composition of Amygdalus mongolica oil

不饱和脂肪酸分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸,两者均能促进血清TC、TG和LDL-C下降,已证实亚油酸具有调节体脂肪储存及降低血脂的功能[23],油酸有明显的降脂作用[24]。蒙古扁桃油的不饱和脂肪酸含量略低于橄榄油的不饱和脂肪酸,然多不饱和脂肪酸占不饱和脂肪酸的比例远大于橄榄油的,亚油酸为人体自身不能合成的必需脂肪酸。因此,蒙古扁桃油可作功能性保健品进行开发。

2.2 蒙古扁桃油对高脂血症大鼠血脂水平的影响

由表3可知,给药干预5周后,与空白对照组比较,蒙古扁桃油对照组血清TC、LDL-C的含量升高不显著,说明蒙古扁桃油不影响血脂水平;正常机体通过血中脂类的利用和转化、贮存之间的动态关系来维持一定的血脂水平,而高脂成分的摄入可以打破这种平衡,本实验通过高脂饲料喂养法建立试验性高脂血症大鼠模型。高脂饲料喂食10周,高脂模型组TC、LDL-C含量极显著高于空白对照组(p<0.01),表明本试验建立的高脂血症模型确实可信,同时印证长期高脂膳食可以导致高脂血症的形成。

表3 蒙古扁桃油对高脂血症大鼠血脂水平的影响(x±s,n=10)Table 3 Effect of Amygdalus mongolica oil on serum lipid(x±s,n=10)

与高脂模型组比较,10 mL/kg蒙古扁桃油组的TC和LDL-C的含量极显著降低(p<0.01),7.5 mL/kg蒙古扁桃油组的TC和LDL-C的含量显著降低(p<0.05或p<0.01),5.0 mL/kg和2.5 mL/kg蒙古扁桃油的TC和LDL-C的含量降低不显著。说明随着剂量的增加,蒙古扁桃油降低TC、LDL-C含量越显著,即给药剂量与效果呈正效关系;在指标TC和LDL-C方面,10 mL/kg蒙古扁桃油组与橄榄油对照组比较无显著性差异,说明蒙古扁桃油和橄榄油具有相似的降血脂作用。

2.3 不同剂量蒙古扁桃油对大鼠肝脏指数的影响

肉眼检查发现(见图1),空白对照组肝脏体积及质量均在正常范围,表面光滑,色红润有光泽,质韧富有弹性。高脂模型组肝脏体积较空白对照组均有所增大,质量增加,肝包膜紧张,表面淡黄,肝缘变钝,触之较对照组略软相对弹性较差,切面淡黄色有油腻感,呈典型脂肪肝形态。与高脂模型组相比,给药组颜色及组织弹性介于高脂模型组与空白对照组之间,均有不同程度的变化。

图1 肝脏直观形态Fig.1 Macroscopic morphology of the liver

脏器系数变化一般反映脏器的肿大、充血、增生肥大、萎缩等,是损伤较为敏感的指标[25]。由表4可知,与空白对照组比较,饲喂基础饲料-蒙古扁桃油对照组肝系数显著升高(p<0.05)。说明高剂量蒙古扁桃油可诱导大鼠肝脏病变;研究表明高脂饲料喂养大鼠可使其肝脏系数增大[25],与空白对照组比较,高脂模型组肝系数极显著升高(p<0.01),符合高脂饮食造成的肝脏脂肪堆积;与高脂模型组比较,10和7.5 mL/kg蒙古扁桃油组大鼠的肝系数显著降低(p<0.05)。5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油组极显著性降低(p<0.01)。说明不同剂量的蒙古扁桃油组都能很好的降低肝系数,尤其是低剂量蒙古扁桃油效果更佳;5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油组肝系数与橄榄油对照组比较无显著性差异,说明低剂量的蒙古扁桃油和橄榄油具有相似的降低肝系数作用。

表4 蒙古扁桃油对大鼠肝脏指数的影响(x±s,n=10)Table 4 Effect of Amygdalus mongolicaoil on liver index(x±s,n=10)

2.4 蒙古扁桃油对高脂血症大鼠肝脏组织MDA、SOD、SOD/MDA和GSH影响

肝脏是物质合成与代谢、能量产生和转换的重要枢纽[26],其自身抗氧化能力高低与肝脏对脂类的合成与代谢密切关系。MDA是生物体内氧化反应产生的代谢物,其含量与与生物体内过氧化的程度呈正相关,组织中MDA的增加可损伤肝细胞,间接反映肝脏受到损伤的程度[27-28]。SOD是人体重要的抗氧化物酶,能够抵抗脂质过氧化物及其中间产物对机体的损伤[29];在细胞中,GSH作为抗氧化剂主要发挥清除体内自由基、抗氧化及调节物质作用[30];两者共同阻止脂质过氧化反应所致的肝细胞损伤。

表5 蒙古扁桃油对高脂血症大鼠肝脏组织MDA、SOD、SOD/MDA和GSH影响(x±s,n=10)Table 5 Effect of Amygdalus mongolica oil on the activities of MDA,SOD,SOD/MDA and GSH in liver of rats(x±s,n=10)

与空白对照组比较,饲喂基础饲料-蒙古扁桃油对照组的MDA、SOD、SOD/MDA升高不显著,GSH降低也不显著。表明10 mL/kg蒙古扁桃油对肝脏无显著的影响;与空白对照组比较,高脂模型组大鼠肝脏组织的MDA含量极显著升高,SOD/MDA比值极显著下降(p<0.01)。说明高脂饮食导致肝脏损伤;与高脂模型组比较,10 mL/kg蒙古扁桃油组大鼠肝脏组织MDA含量极显著降低(p<0.01),SOD/MDA、GSH含量极显著升高(p<0.01),SOD含量显著升高(p<0.05)。7.5 mL/kg蒙古扁桃油组大鼠肝脏组织MDA含量极显著降低(p<0.01),SOD/MDA显著升高(p<0.05)。5.0 mL/kg蒙古扁桃油组大鼠肝脏组织MDA含量极显著降低(p<0.01),SOD/MDA极显著升高(p<0.01)。2.5 mL/kg蒙古扁桃油组大鼠肝脏组织MDA含量极显著降低(p<0.01),SOD、MDA显著升高(p<0.05),SOD/MDA极显著升高(p<0.01)。说明蒙古扁桃油降低MDA含量,同时对提高SOD、GSH活性的作用具有剂量选择性;10 mL/kg蒙古扁桃油组与橄榄油对照组相比,MDA含量变化不显著,说明蒙古扁桃油与橄榄油抵抗肝脏损伤作用相似。

2.5 蒙古扁桃油对大鼠肝脏病理变化的影响

空白对照组肝细胞排列成整齐规则的细胞条索,以中央静脉为中心呈辐射状排列,肝窦清晰可见,未见肝细胞内出现脂滴,无炎症细胞浸润;高脂模型组肝索增宽排列较紊乱,肝血窦变窄甚至消失,肝小叶内可见大片甚至弥漫性脂肪变性的肝细胞,病变以中央静脉周围最为明显。肝细胞肿胀呈多边形,细胞核受脂滴挤压偏向细胞一侧;各给药小组肝细胞索排列不同程度的趋于规则、整齐,肝血窦受挤压程度有所减轻趋势,脂变肝细胞数目减少,胞浆内脂滴减少或消失,尤其是2.5 mL/kg蒙古扁桃油组肝小叶体积及形态更接近正常(见图2)。

图2 各组肝脏HE染色石蜡切片图(×100)Fig.2 High fat diet induced hepatic steatosis(×100)

2.6 量效关系及相关参数

拟合蒙古扁桃油的量效关系(见图3)得到函数关系见表6),综合分析各剂量组对TC、LDL-C、MDA的效应变化:随着剂量的逐渐增加,TC、LDL-C含量降低越明显,MDA含量升高越明显。

图3 蒙古扁桃油剂量变化与TC、LDL-C、MDA值的量效关系Fig.3 The relationship between dosage change of Amygdalus mongolica oil and values of TC,LDL-C,MDA

表6 蒙古扁桃油剂量变化与TC、LDL-C、MDA值的函数关系Table 6 The function relationship between dosage change ofAmygdalus mongolica oil and values of TC,LDL-C,MDA

量效关系是在不同的剂量下产生不同的效果的变化规律,通常是在一定的剂量范围内,效果随着剂量的增加而增加或降低。本试验通过曲线拟合,得出TC、LDL-C和MDA与蒙古扁桃油剂量Y的经验方程,从而可以预测2.5 mL/kg≤Y≤10 mL/kg范围内TC、LDL-C和MDA所能达到的理论值,该理论值可作为蒙古扁桃油剂量确定提供参考依据。

3 结论

本实验采用高脂饮食诱导大鼠高脂血症模型,比较蒙古扁桃油与橄榄油的成分、对高脂血症大鼠降血脂作用以及肝脏功能的影响。结果显示:蒙古扁桃油比橄榄油富含FUFA。相同剂量的蒙古扁桃油比橄榄油降血脂作用更突出。5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油组与橄榄油抑制肝脏指数下降作用相似。通过对大鼠肝脏组织的检测进一步发现蒙古扁桃油能够降低肝脏组织MDA水平(p<0.05),同时提高SOD、GSH的活力(p<0.05)。10 mL/kg蒙古扁桃油组与橄榄油抗肝脏损伤相似,并且随着剂量越低,蒙古扁桃油抵抗肝脏损伤越显著。肝脏HE染色表明蒙古扁桃油能保护肝脏,低剂量效果更优。拟合量效关系曲线显示:TC、LDL-C与剂量呈负效关系,MDA与剂量呈正效关系。研究表明蒙古扁桃油富含不饱和脂肪酸具有降血脂作用,可能通过增强肝脏组织抗氧化酶和抗氧化剂的活力,有效发挥肝脏修复高脂血症肝脏组织的能力,可作为功能食用油辅助高脂血症和脂肪肝的治疗。