韩明虎,王春林,胡浩斌,武 芸,张腊腊

(1.陇东学院化学化工学院,甘肃庆阳 745000; 2.庆阳市果业管理局,甘肃庆阳 745000)

苹果中含有丰富的多酚、植物甾醇、糖类、苹果酸、维生素、蛋白质和微量元素等营养物质,是人们长期喜爱的水果[1-2]。苹果多酚作为多羟基苯环结构的天然产物,包含绿原酸、对香豆酸、儿茶素、槲皮素、根皮苷、原花青素等[3]生物活性组分,具有抗癌、抗龋齿、抗菌消炎、抗氧化过敏、抗疲劳衰老和抗动脉硬化等功能[4],可增强体质和调节脂代谢,预防心脑血管、哮喘、中风及糖尿病,是治疗三高和冠心病的辅助良药,广泛应用于食品医药和美容保健领域[5]。一定条件下苹果多酚对DPPH自由基的清除能力是茶多酚的100多倍,VE的10～30倍,VC的2～3倍[6],抑制油脂的氧化能力明显强于二丁基羟基甲苯(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ),保鲜护色作用持久,协同效率高,是天然的抗氧化剂[7-8]。苹果多酚对葡萄球菌、大肠杆菌及致龋菌等多类细菌有很强的抑制作用,抗菌能力优于茶多酚和皂苷,受环境影响小,长期食用有益于人体健康[9-10]。苹果多酚中不仅包含大量的黄酮和类黄酮成分,对肝癌、结肠癌和乳腺癌均有较好的预防与抑制增长效果,而且缩合单宁、原花青素等能够通过抑制ACE的活性有效防止血压升高,在医药上应用前景广阔[11-12]。

我国是世界苹果产量最大的国家,庆阳市地处陇东黄土高原,气候温和,光照充足,苹果色泽鲜艳、酸甜适度且品质优良,是我国优质苹果种植和生产的重要基地[13],近年来庆阳苹果大量销往全国各地,受到了消费者一致好评,但对其理化指标和多元酚类物质的分析研究未见报道。

因此,本文通过考察庆阳各县区苹果的主要理化指标确定待测果样,采用微波-超声-纤维素酶辅助法提取多酚,对比分析10个县区果样中总酚和主要多酚组分及含量,为庆阳苹果多酚的产业化提供数据参考,对于庆阳苹果的深加工和提升附加值具有一定的的理论意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红富士苹果 采自庆阳市西峰区(黄官寨村和刘家店村)、庆城县、合水县、镇原县、宁县、正宁县、环县等7县区8个示范果园点,依次编号01～08,静宁和洛川红富士苹果作参比果样,分别编号09和10;抗坏血酸(VC)、钼酸钠、盐酸 西安化学试剂厂;磷酸、硫酸锂 成都市科龙化工试剂厂;溴水 天津市凯信化学工业有限公司;磷酸氢二钠 天津市百世化工有限公司;磷酸二氢钾 天津市天力化学试剂有限公司;钨酸钠 上海中泰化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯;纤维素酶(10000 U/g) 上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇、无水甲醇 高效液相色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;没食子酸、对香豆酸、儿茶素、表儿茶素、根皮苷 标准品,贵州迪大生物科技有限责任公司;绿原酸、芦丁 标准品,中国药品生物制品检定所。

JJ-1型精密增力电动搅拌器 常州澳华仪器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海恒科学仪器有限公司;Agilent1260型高效液相色谱仪 日本安捷伦公司;SPECORD-50型紫外可见分光光度计 德国耶拿公司;RE-2000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-DⅢ型循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;GA 92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 无锡市上佳生物科技有限公司;NJL07-5型实验室超声微波炉 南京杰全微波设备有限公司;FTA型水果质地分析仪 南京欧熙科贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 理化指标 将果箱(12个/箱)中苹果随机编号1～12,按双数选取6个苹果作为待测果样,称其单果重量,测量果实纵径和横径,果形指数为果实纵径与横径的比值;水果质地分析仪测量硬度;根据GB12456-2008中pH电位法测定总酸含量;按NY/T 1278-2007农业行业标准中方法测定总糖含量和可溶性固形物含量;酶标仪测定VC含量,6组测量结果取平均值,确定各样果的主要理化指标。

1.2.2 多酚提取 取500 g苹果,超纯水清洗干净,去果核并带皮切割成1 cm3小块备用。称取50 g苹果碎块置于1000 mL的烧杯中,加1%的VC防止褐变,按料液比1∶6加入300 mL的80%乙醇和纤维素酶0.5 g,搅拌均匀后置于微波炉中浸提70 s(640 W,40 ℃),然后在超声装置中反应15 min(130 W,20 kHz,60次,t=5 s,间隔10 s),抽滤弃掉滤渣,滤液真空浓缩(60～80 r/min,40 ℃),用甲醇定容至100 mL,4 ℃下贮存备用。

1.2.3 总酚含量测定 以没食子酸为标准物质,采用Flin-Ciocalteu(F-C)比色法测定苹果中总酚的含量[5]。

1.2.3.1 标准曲线的绘制 精确称取5 mg没食子酸标准品,加超纯水定容于25 mL棕色容量瓶中,摇匀即得标准溶液。量取没食子酸标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中,各加6 mL的超纯水,摇匀后加0.5 mL的F-C试剂和1.5 mL Na2CO3溶液,超纯水定容并摇匀,将容量瓶放置30 ℃的水浴中反应2 h。以0 mL的标品溶液为空白参比,用1 cm比色皿测定波长760 nm处的吸光度并将没食子酸浓度与吸光度进行线性回归。回归方程为:y=112.58x+0.2297,R2=0.9996,表明总酚含量在0.004～0.020 mg/mL间吸光度和质量浓度的线性关系良好。

1.2.3.2 样品测定 取1.2.2项提取的多酚试样50 μL置于10 mL棕色容量瓶中,加6 mL的超纯水,0.5 mL F-C试剂,1.5 mL Na2CO3溶液,超纯水定容后摇匀,30 ℃的水浴中反应2 h。以不含多酚试样的定容试剂为空白参比,用1 cm比色皿测定波长760 nm处的吸光度。将各样品3次吸光度的平均值代入没食子酸的标准曲线中,得到总酚浓度,并按式(1)计算总酚含量。

式(1)

式中:x-试样中总酚含量(mg/g);c-校准曲线总酚的浓度(mg/mL);v1-稀释体积(10 mL);v2-样品溶液的体积(100 mL);v3-取样体积(0.05 mL);M-样品质量(50 g)。

1.2.4 多酚组分及含量的分析 采用HPLC法测定苹果中多酚组分及含量。

1.2.4.1 标样制备 分别精确称取1 mg各标准品,分别用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中制备标样。

1.2.4.2 色谱条件 ZORBAX SB C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A为2 mmol/L磷酸缓冲液(0.45 μL膜过滤),流动相B为甲醇;进样量10 μL,流速0.6 mL·min-1,柱温30 ℃,检测波长280 nm;梯度洗脱程序:0～10 min,B为10.0%;10～20 min,B为20.0%;20～30 min,B为35.0%;30～50 min,B为39.5%。

1.2.4.3 测定方法 根据峰保留时间、峰型、峰面积对照标准品HPLC图,确定6种多酚组分,采用外标法,按式(2)和(3)分别计算各样果鲜果和干果中多酚含量。

Cx=Cr·(Ax·V/Ar·M)

式(2)

C=Cx/0.1783

式(3)

式中:Ax-苹果试样峰面积或峰高(mAU·s);Cx-鲜苹果中多酚含量(mg/g);Ar-标准品的峰面积或峰高(mAU·s);Cr-标准品的浓度(0.1 mg/mL);V-样品溶液的体积(100 mL);M-样品质量(50 g);0.1783-干果质量分数(17.83%)。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,所有数据取平行实验的平均值,在色谱化学工作站中调用信号,对实验数据采用SPSS 19.0、Excel 2010进行统计分析,并导出HPLC图。

2 结果与分析

2.1 理化指标分析

各样果的主要理化指标测定结果见表1。

表1 各样果的主要理化指标Table 1 Main physicochemical indexes of apple samples

由表1可见,庆阳各县区(01～08)样果单果重量为255.19～381.88 g,单果重量与生长地域、果内水分有关,虽然标准偏差较大,但选样均符合检测要求(≥200 g)。果实横径82.10～94.33 cm,果实纵径73.03～85.32 cm,果形指数0.81～0.92,硬度6.86～8.19 kg/cm2,可溶性固形物含量13.34%～14.96%,总酸含量0.36%～0.45%,总糖含量12.00%～13.37%,VC含量5.27～8.56 mg/100 g,与静宁(09)和洛川苹果(10)同比,果实较大,果形饱满圆润,硬度、酸度和可溶性固形物含量适中,总糖含量略低,VC含量较高,无缺陷、伤痕或裂纹,依据GB/T 10651-2008,说明采样符合优质苹果标准,均属于精品果[14]。

2.2 总酚含量

准确称取50 g切碎的苹果,静置风干72 h,称量为8.9129 g,记为干果重量。则鲜果含水量为82.17%,测得各样果中总酚含量如表2所示。

表2 各样果中多酚的组成Table 2 Composition of polyphenols of apple samples

由表2可见,庆阳各县区(01～08)样果中鲜果总酚含量为0.723～1.088 mg/g,干果总酚含量为4.086～6.102 mg/g,与静宁(09)和洛川(10)苹果相比,庆城县苹果的总酚含量略低,可能是由于苹果成熟期前2周阴雨连绵、光照不足所致;宁县苹果总酚含量最低,可能是因为八月份连续遭遇两次小冰雹,果熟前的多场暴雨天气所导致。总体而言,庆阳作为我国重要的苹果产地,今年各县区红富士苹果总酚含量普遍较高,开发前景较好。

2.3 多酚组分及含量

对6种标准品进样分析(图1),确定对香豆酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、根皮苷的出峰保留时间分别为2.645、6.600、20.736、26.388、32.517和34.185 min,对照即可定性。对各样果进样分析,如图2～图3所示。

图1 各标准品的HPLC图Fig.1 HPLC diagram of standard substance

图2 各样果中对香豆酸的HPLC图Fig.2 HPLC diagram of p-coumaric acid of apple samples

图3 各样果中其它5种多酚的HPLC图Fig.3 HPLC diagram of the other 5 kinds of polyphenols of apple samples

由图2～图3可见,庆阳各县区(01～08)样果中均含有丰富的多酚组分,与图1对照可确定2.394～2.531 min为对香豆酸,6.843～7.934 min为绿原酸,19.261～21.487 min为儿茶素,25.681～26.715 min为表儿茶素,30.578～32.582 min为芦丁,33.921～35.541 min为根皮苷,均与标准品出峰时间相近,峰型和峰宽理想,测量结果准确可靠。

采用外标法计算鲜果中6种主要多酚组分含量(表2):绿原酸0.111～0.154 mg/g,对香豆酸0.157～0.256 mg/g,儿茶素0.005～0.021 mg/g,表儿茶素0.016～0.080 mg/g,芦丁0.031～0.078 mg/g,根皮苷0.011～0.022 mg/g。庆阳各县区鲜苹果总酚含量为0.723～1.088 mg/g。干果中多酚含量高于鲜果且变化趋势一致。

与静宁(09)和洛川(10)苹果相比,庆阳苹果中绿原酸含量较高,对香豆酸含量相近,西峰区(01～02)、正宁县(07)及环县(08)苹果中6种总酚含量均高于庆阳其它县区,对香豆酸和绿原酸含量相对其它4种多酚偏高,推测苹果果实发育过程中二者含量下降较慢,而它们均有抑菌抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压血脂和提高免疫力等生物活性[11],所以庆阳苹果整体上具有较好的功能活性。此外,洛川(10)苹果中芦丁含量最低,庆阳(01～08)苹果中芦丁含量远高于洛川苹果,整体略低于静宁(09)苹果,作为维生素类药,芦丁能降低毛细血管的通透性和脆性,保持弹性,是防治脑血栓、脑溢血、视网膜出血、心脑血管和紫癜等疾病的辅助用药[12],因而庆阳苹果具有一定的保健功效。镇原(05)和宁县(06)苹果中儿茶素含量偏低,其它县区偏差不大,宁县(06)苹果中表儿茶素含量较低,静宁(09)苹果中根皮苷含量最高。儿茶素、表儿茶素和根皮苷都具有防止脂肪沉积、降血糖和改善记忆力等效用[15],多酚组分的多样性体现出庆阳苹果的深加工价值。总之,庆阳苹果中多酚组分及含量符合国家优质苹果的标准和要求,可广泛应用于食品、保健、医药等领域[26-27],具有一定的开发价值。

西峰(01～02)、镇原(05)、环县(08)和静宁(09)的样果HPLC图在14.668～16.574 min出现较好吸收峰,庆城(03)、合水(04)、镇原(05)、正宁(07)和静宁(09)在23.833～24.336 min出现较好吸收峰,说明存在部分差异性多酚组分未能定性。苹果多酚受到品种、种植地点、收获时间和提取方式等多种因素影响,这种差异性有待进一步研究。

3 结论

庆阳各县区鲜苹果中总酚含量为0.723～1.088 mg/g,鲜苹果中6种主要多酚组成分别为绿原酸0.111～0.154 mg/g,对香豆酸0.157～0.256 mg/g,儿茶素0.005～0.021 mg/g,表儿茶素0.016～0.080 mg/g,芦丁0.031～0.078 mg/g,根皮苷0.011～0.022 mg/g。该方法提取时间短(约16 min),效率高,溶剂用量少,毒性低,操作简单,成本低,是苹果多酚提取的新方法。对比分析庆阳各县区与静宁、洛川苹果的主要理化指标、总酚和多酚组分含量,表明庆阳苹果品质优良、酚类多、含量高和营养价值丰富,具有较优的应用价值。本研究为庆阳各县区优质苹果的栽培、生产提供参考和指导,促进陇东地区苹果产业的发展,提高农业经济价值。