吴 强,陈 韬,*,朱 姗,朱铁花,李燕清,杨汝男,李华健,舒国涛,许家银

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201; 2.武定永银农产品开发有限公司,云南武定 651600)

莲藕(NelumbonucifereGaertn)又称荷藕,属于睡莲科植物[1],广泛分布于中国各省,是我国种植规模较大的水生蔬菜[2]。云南省玉溪市澄江县莲藕种植面积3630亩,藕粉年产量达到1674吨。藕粉生产中会产生大量莲藕下脚料—藕渣,目前国内藕渣综合利用程度较低,主要作为饲料或废弃物丢掉,造成一定的资源浪费与环境污染[3]。有研究表明,藕渣含有丰富的膳食纤维[4],且膳食纤维对人体的健康益处已被国内外研究证实[5-7],因此提取藕渣中的膳食纤维是开发利用藕渣和提高其附加值的有效方法之一。

膳食纤维提取方法有化学提取法、酶提取法、酶-化学法、物理法及发酵法[8-12]。国内外主要采用化学提取法提取膳食纤维,但该法所提取的膳食纤维具有色泽差、漂白难,且生产过程中会产生大量废水等缺点[13-14]。酶-化学法具有提取条件较温和,提取的膳食纤维物理性质(持水性、溶胀性)较强以及产品纯度较高等优点[15]。酶-化学法较为常见的提取流程可分为先碱解后酶解[16]和先酶解后碱解[17]两种工艺,实验初期采用酶化学法(先碱解后酶解)提取藕渣IDF,但发现先碱解后藕渣样品呈现出胶凝结块的现象,不利于随后的酶解反应和藕渣IDF的提取。此外,有报道称IDF的物理性质(持水性、溶胀性、色泽等)不仅与其在食品中的加工性能相关,还直接影响其在肠道中的功能特性[18]。

因此本实验采用先酶解后碱解的酶化学法对提取工艺参数进行筛选与优化,并研究分析了该方法所制得藕渣IDF的理化性质(持油性、持水性、溶胀性、色泽),为促进藕渣资源开发功能性膳食纤维食品添加剂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藕渣 云南玉溪澄江藕粉厂;石油醚 分析纯,成都市科隆化学品有限公司;氢氧化钠、无水乙醇 分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;盐酸 分析纯,重庆川东化工(集团)有限公司;热稳定α-淀粉酶液(酶活力为38500 IU/g) 上海阿拉丁生化有限公司;碱性蛋白酶(酶活力为200000 U/g)、糖化酶(酶活力为100000 U/g)、硅藻土、MES-TRIS缓冲试剂 北京索莱宝科技有限公司。

SE206型脂肪测定仪 济南阿尔瓦仪器有限公司;K9840型自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;SX2-4-10型箱式电阻炉 上海跃进医疗器械厂;HH-8型数显恒温水浴锅 金坛市城西峥嵘实验仪器厂;WHY-2型水浴恒温振荡器 金坛市大地自动化仪器厂;GZX-GF101-3-BS型电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司;AR224CN型电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司;SHZ-D(III)型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;HC-3018R型高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;DFT-100型手提式高速中药粉碎机 温岭市林大机械有限公司;HI9024型pH计 意大利哈纳HANNA仪器公司;CR-400/410型色差计 日本 Konica Minolta公司。

1.2 实验方法

1.2.1 藕渣主要成分分析 将湿样藕渣于干燥箱75 ℃条件进行烘干粉碎过60目筛备用,进行主要成分分析。采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》[19]测定藕渣中总膳食纤维(TDF)、不溶性膳食纤维(IDF);藕渣的水分、灰分、蛋白质、脂肪含量的测定分别参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》[20]、GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》[21]、GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》[22]、GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》[23]规定的方法进行。藕渣的色泽测定参照周禹含[24]采用色差计测定并记录藕渣的亮度值(L*),红度值(a*),黄度值(b*)。

1.2.2 藕渣IDF的制备流程及纯度测定 参照Cheickna等[25]对米糠膳食纤维的提取工艺做相应修改,称取1.0000 g的脱脂藕渣,与30倍体积的pH=8.2的Mes-Tris缓冲液混合并用盐酸调至pH=7,加入一定量的热稳定α-淀粉酶于95 ℃反应一段时间,然后用氢氧化钠调pH=8,加入一定量的碱性蛋白酶在50 ℃反应60 min,用盐酸调至pH=4.5,加入100 μL的淀粉葡糖甘酶于60 ℃水浴30 min,4000 r/min离心15 min除去上清液,浸泡于15倍体积一定浓度的氢氧化钠溶液中,于60 ℃水浴一定时间,然后4000 r/min离心15 min,分别经蒸馏水洗涤至中性,30 mL的70 ℃热水洗涤以及30 mL的95%乙醇洗涤,抽滤干燥得藕渣IDF。

参照酶重量法[19]并做相应修改,取两份经干燥粉碎过60目的等质量的(m)藕渣IDF样品,经过蛋白质与灰分测定,分别计算出该样品的蛋白质含量(m1)与灰分含量(m2)然后通过以下公式计算藕渣IDF得率及纯度。

1.2.3 单因素实验设计 称取1.0000 g过60目脱脂藕渣样品,以藕渣IDF得率为考察指标,分别研究淀粉酶添加量、淀粉酶酶解时间、蛋白酶添加量、氢氧化钠浓度、碱解时间对藕渣IDF得率的影响。

1.2.3.1 热稳定α-淀粉酶添加量对藕渣IDF得率的影响 选取0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%不同热稳定α-淀粉酶添加量,在氢氧化钠浓度0.3 mol/L、碱解时间45 min、淀粉酶酶解时间60 min、碱性蛋白酶添加量5%时,研究热稳定α-淀粉酶添加量对藕渣IDF得率的影响。

1.2.3.2 热稳定α-淀粉酶酶解时间对藕渣IDF得率的影响 选取30、45、60、75、90 min不同酶解时间,在氢氧化钠浓度0.3 mol/L、碱解时间45 min、热稳定α-淀粉酶添加量0.5%、碱性蛋白酶添加量5%时,研究热稳定α-淀粉酶酶解时间对藕渣IDF得率的影响。

1.2.3.3 碱性蛋白酶添加量对藕渣IDF得率的影响 选取2%、3%、4%、5%、6%不同碱性蛋白酶添加量,在氢氧化钠浓度0.3 mol/L、碱解时间45 min、热稳定α-淀粉酶添加量0.5%、热稳定α-淀粉酶酶解时间60 min时,研究碱性蛋白酶添加量对藕渣IDF得率的影响。

1.2.3.4 氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响 选取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L不同浓度的氢氧化钠溶液,在碱解时间45 min、热稳定α-淀粉酶添加量0.5%、热稳定α-淀粉酶酶解时间60 min、碱性蛋白酶添加量5%时,研究氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响。

1.2.3.5 碱解时间对藕渣IDF得率的影响 选取45、60、75、90、105 min不同碱解时间,在氢氧化钠浓度0.3 mol/L、热稳定α-淀粉酶添加量0.5%、淀粉酶酶解时间60 min、碱性蛋白酶添加量5%时,研究碱解时间对藕渣IDF得率的影响。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验结果的基础上,选取对藕渣IDF得率影响程度较大的四个因素;以氢氧化钠浓度(A)、碱解时间(B)、热稳定α-淀粉酶酶解时间(C)、碱性蛋白酶添加量(D)因素为响应面试验因素,响应面水平设计如表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in the response surface design

1.2.5 理化特性分析

1.2.5.1 持水性测定 参照Wang等[26]方法,准确称取藕渣IDF为1.000 g置于50 mL的离心管,加入30 mL的蒸馏水,在室温条件下,常温振荡搅拌1 h后,在5300 r/min的转速下离心10 min取出,倾倒上清液,甩干水分称重。持水性计算公式为:

式中:W-持水性,g/g;M-样品干重,g;M1-样品湿重,g。

1.2.5.2 溶胀性测定 参照Tosh等[27]方法,准确称取藕渣IDF为1.000 g置于10 mL量筒中,用移液枪准确移取5 mL蒸馏水于量筒中,振荡均匀后在室温下放置24 h读取液体中膳食纤维的体积。溶胀性计算公式为:

式中:S-溶胀性,mL/g;V1-溶胀后体积,mL;V-干品体积,mL;M-样品干重,g。

1.2.5.3 持油性测定 参照孔令明等[9]方法,准确称取藕渣IDF为1.000 g置于离心管中,加入食用菜籽油8 g,混合均匀后于室温静止1 h,离心(5300 r/min,20 min)倾去上层菜籽油,滤渣用滤纸吸干游离的菜籽油,称重,持油性计算公式为:

式中:O-持油性,g/g;M-样品干重,g;M1-样品湿重,g。

1.2.5.4 色泽测定 参照张玉荣等[28]方法,将粉状样品置于样品测试杯中,经填实、压平后进行测定,平行测定4次取平均值,记录藕渣IDF的L*、a*、b*值。

1.3 数据处理

实验结果以平均值±标准差表示,单因素实验采用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析、Ducan’s多重比较,Origin8.0进行图片处理,响应面优化采用Design-Expert 8.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 干样藕渣的理化性质及色泽的测定

由表2可知,干样藕渣是丰富的膳食纤维来源,其中藕渣IDF占总膳食纤维的92.87%;此外,干样藕渣还有一定量的蛋白质及脂肪;在色泽方面上,干样藕渣呈现出黄色色泽。

表2 干样藕渣理化性质分析Table 2 Physicochemical properties analysis of dried lotus residue

2.2 单因素实验

2.2.1 热稳定α-淀粉酶添加量对藕渣IDF得率的影响 由图1可知,在较低的热稳定α-淀粉酶添加量范围内,藕渣IDF得率增加但无显著变化,当热稳定α-淀粉酶添加量为0.6%时,藕渣IDF得率最高为29.49%,随着淀粉酶添加量的继续上升,IDF得率降低但变化不明显,这可能是由于淀粉酶的添加量趋于过饱和状态,反而导致藕渣IDF得率降低[29]。从提取成本方面及得率考虑,确定热稳定α-淀粉酶添加量为0.6%较为合适。

图1 热稳定α-淀粉酶添加量对藕渣IDF得率的影响Fig.1 Effect of α-amylase addition on IDF extraction rate of lotus root residues注:不同字母表示差异显著(p<0.05)，图2～图5同。

2.2.2 热稳定α-淀粉酶酶解时间对藕渣IDF得率的影响 由图2可知,酶解时间在30～60 min范围时,藕渣IDF整体得率呈现出略微下降的趋势,这可能是由于随着酶解时间的增加,热稳定α-淀粉酶不断水解淀粉,使得藕渣IDF制备过程中残留的杂质变少,粗制备物得率相对下降;但随着酶解时间的继续增加,由75～90 min时,藕渣IDF得率显著下降(p<0.05),这可能是由于在酶解温度为95 ℃高温条件下,较长时间的酶解对藕渣IDF的结构和组成成分破坏引起的不溶性物质溶解度增加,导致IDF得率下降。综合考虑选择酶解时间为75 min。

图2 热稳定α-淀粉酶酶解时间对藕渣IDF得率的影响Fig.2 Effect of α-amylase hydrolysis time on IDF extraction rate of lotus root residues

2.2.3 碱性蛋白酶添加量对藕渣IDF得率的影响 由图3可知,随着碱性蛋白酶添加量的增加,藕渣IDF得率呈先降低后升高再降低的趋势。其中,在碱性蛋白酶添加量为3%时,藕渣IDF得率最低。但当碱性蛋白酶添加量为4%时,随着添加量的继续增加,IDF得率变化程度略微减少,从节约酶用量的角度及IDF得率变化程度考虑,选择碱性蛋白酶添加量范围为2%～4%较为合适。

图3 碱性蛋白酶添加量对藕渣IDF得率的影响Fig.3 Effect of alcalase addition on IDF extraction rate of lotus root residues

2.2.4 氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响 由图4可知,随着氢氧化钠浓度的增加,藕渣IDF得率整体趋势先升高后降低最后趋于平稳(且在这个过程中,藕渣IDF色泽发生由黄色向棕黄色的转变)。在氢氧化钠浓度为0.5 mol/L时,藕渣IDF得率最高。这可能是由于纤维素、半纤维素及木质素等不溶性膳食纤维在较高的氢氧化钠浓度下发生部分的水解[30-31]。因此,出于藕渣IDF得率及色泽方面的考虑,氢氧化钠的浓度选为0.5 mol/L较合适。

图4 氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响Fig.4 Effects of concentration of NaOH on IDF extraction ratio of lotus root residues

2.2.5 碱解时间对藕渣IDF得率的影响 由图5可知,随着碱解时间的延长,藕渣IDF得率呈先减小后增加的趋势,但总体变化差异不显著。当碱解时间为90 min时,藕渣IDF得率最高为26.42%,因此碱解时间选为90 min。

图5 碱解时间对藕渣IDF得率的影响 Fig.5 Effects of alkali extraction time on IDF extraction ratio of lotus root residues

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计结果及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件,按照Box-Behnken试验设计,依据单因素实验结果选取氢氧化钠浓度(A)、碱解时间(B)、热稳定α-淀粉酶解时间(C)、碱性蛋白酶添加量(D)4个因素为自变量,藕渣IDF得率为响应值,设计4因素3水平响应面分析试验。试验设计结果见表3。方差分析表详见表4。

表3 藕渣IDF得率响应面试验设计及结果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis of Lotus residue IDF

根据表4的数据得出编码的二次回归方程为:

Y=27.34+0.47A+0.38B-0.037C+0.0013D-0.41AB-0.76AC-0.45AD-0.066BC+0.083BD+0.88CD-0.59A2-0.47B2+0.051C2+0.34D2

根据表4的数据得出实际的二次回归方程为:

表4 藕渣IDF得率响应面试验方差分析表Table 4 Variance analysis for extraction rate of Lotus residue IDF

Y=-29.73+139.61A+0.54B+0.068C-4.67D-0.27AB-0.51AC-4.53AD-0.00029BC+0.0056BD+0.059CD-58.62A2-0.0021B2+0.00023C2+0.33656D2

2.3.2 响应面交互作用等高线分析 保持氢氧化钠浓度、碱解时间、热稳定α-淀粉酶酶解时间、碱性蛋白酶添加量4个变量中的2个变量在0水平,藕渣IDF得率随另外两个变量在相应范围内变化趋势如图6～图9所示。

图6 碱解时间与氢氧化钠浓度的响应面图Fig.6 Response surface for alkali soaking time and NaOH concentration alkali soaking time

图7 淀粉酶酶解时间与氢氧化钠浓度的响应面Fig.7 Response surface for α-amylase hydrolysis time and NaOH concentration

图8 碱性蛋白酶添加量与氢氧化钠浓度的响应面图Fig.8 Response surface for alcalase addition and NaOH concentration

图9 淀粉酶酶解时间与碱性蛋白酶添加量的响应面图Fig.9 Response surface for α-amylase time and alcalase addition

响应面图可分为曲面图与等高线图两部分,因此响应面分析常结合这两部分进行分析。一方面,可通过观察曲面图的陡峭程度,用来反映因素间的交互效应对响应值的影响程度大小;另一方面,还可从等高线的形状、排列的密集程度方面,用来判断因素间的交互作用及对响应值的影响程度[32-33]。

由图6可知,曲面较陡峭,说明碱解时间和氢氧化钠浓度之间交互作用对藕渣IDF得率影响显著,与方差分析表结果相一致(p<0.05);图6等高线呈椭圆形,且等高线沿着氢氧化钠浓度轴向较碱解时间轴向密集,说明氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响程度高于碱解时间;图6可知,当碱解时间一定时,藕渣IDF得率随着氢氧化钠浓度的增加呈现出先升高后降低,在氢氧化钠浓度为0.5～0.55 mol/L时,藕渣IDF得率较高。

由图7可知,曲面陡峭,说明热稳定α-淀粉酶酶解时间和氢氧化钠浓度之间交互作用对藕渣IDF得率影响极显著,与方差分析表结果相一致(p<0.01);图7等高线呈椭圆形,且等高线沿着氢氧化钠浓度轴向较淀粉酶酶解时间轴向密集,说明氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响程度高于淀粉酶解时间;同时由图7可以看出淀粉酶酶解时间在60 min、氢氧化钠浓度在0.6 mol/L时,藕渣IDF得率最高。

由图8可知,曲面较陡峭,说明蛋白酶添加量和氢氧化钠浓度之间交互作用对藕渣IDF得率影响显著,与方差分析表结果相一致(p<0.05);图8等高线呈椭圆形,且等高线沿着氢氧化钠浓度轴向较蛋白酶添加量轴向密集,说明氢氧化钠浓度对藕渣IDF得率的影响程度高于蛋白酶添加量;图8可以看出,蛋白酶添加量在2%、氢氧化钠浓度在0.6 mol/L时,藕渣IDF得率最高。

由图9可知,曲面凹陡峭,说明热稳定α-淀粉酶酶解时间和蛋白酶添加量之间交互作用对藕渣IDF得率影响极显著,与方差分析表结果相一致(p<0.01);图9等高线呈椭圆形,且等高线沿着蛋白酶添加量轴向较淀粉酶酶解时间轴向稀疏,说明蛋白酶添加量对藕渣IDF得率的影响程度低于淀粉酶酶解时间;同时由图9可以看出淀粉酶酶解时间在90 min、蛋白酶添加量在4%时,藕渣IDF得率较高。

2.3.3 最佳工艺条件的预测和验证实验 经Design-Expert 8.0.6软件分析处理,对拟合的回归方程在藕渣IDF得率范围25%～30%取最大值得到藕渣IDF最佳提取工艺参数为:NaOH浓度A=0.60 mol/L,碱解时间B=89.58 min,稳定α-淀粉酶酶解时间C=60 min,碱性蛋白酶D=2%。此时藕渣IDF预测得率为29.75%。

考虑到实际可操作性,将工艺条件参数修正为NaOH浓度A=0.60 mol/L,碱解时间B=90 min,热稳定α-淀粉酶酶解时间C=60 min,碱性蛋白酶D=2%。用此提取工艺参数条件进行验证实验,通过实验得到藕渣IDF得率为29.90%±0.06%,与理论得率较为接近,说明回归方程较好地预测酶化学法提取藕渣IDF的实际效果,具有可行性与实际应用价值。此时采用酶重量法[19]测定藕渣IDF的纯度达到91.93%±1.16%。

2.4 藕渣IDF性能、色泽测定

与结果2.1(表2)相比,在色泽方面,藕渣IDF的L*值低于藕渣的L*值,藕渣IDF的a*值高于藕渣的a*值,藕渣IDF的b*值低于藕渣的b*值。这可能是由于酶化学法在降解非膳食纤维物质时转变成一些小分子而引起对色泽的变化。

由表5可知,通过酶化学法(先酶解后碱解)的最佳提取工艺制得的藕渣IDF性能分别为持水性为6.58±0.25 g/g、持油性为4.73±0.33 g/g、膨胀性为3.03±0.12 mL/g。

表5 藕渣IDF的性能及色泽指标测定Table 5 The performance and color ’s determination of lotus root IDF

3 结论

影响酶化学法(先酶解后碱解)提取藕渣IDF得率程度大小依次为:氢氧化钠浓度>碱解时间>热稳定α-淀粉酶酶解时间>碱性蛋白酶添加量。最佳工艺条件为:NaOH浓度0.60 mol/L,碱解时间90 min,热稳定α-淀粉酶酶解时间60 min,碱性蛋白酶2%。在此条件下,藕渣IDF的得率29.90%±0.06%,藕渣IDF的纯度为91.93%±1.16%,持水性6.58±0.25 g/g,持油性4.73±0.33 g/g,膨胀性3.03±0.12 ml/g。此外,藕渣IDF的亮度值(L*)为38.266±0.187,红度值(a*)为3.412±0.027,黄度值(b*)值为5.268±0.042。因此,藕渣IDF的最佳提取工艺条件是可行的,为藕渣开发利用提供一定的理论依据。