张蒙娜,宋恭帅,彭 茜,薛 静,戴志远,2

(1.浙江工商大学 海洋食品研究院,浙江杭州 310000；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江杭州 310000)

沙丁鱼(Sardinellasp.)是一种小型集群性洄游鱼类,富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等营养成分,分布于东北大西洋、地中海等海域,具有生长快、繁殖能力强等优点,被大量捕获和消费。除小部分流通于零售市场外,其主要作为进一步加工的原材料,如加工成油浸罐头、冷冻鱼丸、油炸鱼丸、鱼香肠等多种方便食品[1]。此外,黄嘉成等[2]以沙丁鱼为原料,制备沙丁鱼ACE抑制肽,通过工艺优化,最终使水解蛋白肽的ACE抑制率达到73.44%,实现了对低值沙丁鱼的高效利用。沙丁鱼含油量较高,其中多不饱和脂肪酸含量高,故将沙丁鱼作为生产精制鱼油的原料具有较大的经济价值[3]。鱼油中的n-3系列多不饱和脂肪酸,对人类的健康和营养具有重要作用[4]。其中,二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是存在于大脑、视网膜、精子及神经组织中的重要生物活性物质,具有预防动脉硬化和心脑血管疾病、调节机体脂质代谢、预防癌症、防止大脑衰老、抗炎作用等生理保健功能[5-10]。

鱼油产品按存在形式的不同,可分为甘油三酯型和乙酯型。甘油三酯型的EPA和DHA含量较低[11],而乙酯型鱼油具有易富集不饱和脂肪酸、沸点低、无毒副作用、能耗低及便于包装和运输等优点[12],因此,将精制鱼油经乙酯化工艺处理,获得乙酯型鱼油从而更有效地富集n-3系列不饱和脂肪酸,满足消费者的需求,是当今鱼油行业值得研究的一个方面[13-15]。鱼油乙酯化的方法主要有3种:酶催化法、酸催化法和碱催化法[16]。酶催化法所需酶制剂价格昂贵,不适合规模化生产[17],而酸催化法多应用于酸价高的甘油酯且反应速率慢[18]。碱催化法一般采用低成本的NaOH或KOH作为催化剂[19],其催化速率快且在较低温度条件下操作,可有效避免鱼油中营养成分的流失[20-21]。

因此,本研究以精制沙丁鱼油为原料,采用碱催化法对其进行乙酯化工艺优化的探究,研究无水乙醇使用量、NaOH使用量、反应时间、反应温度对乙酯率的影响,并通过响应面法确定最佳乙酯化工艺参数,以期为精制沙丁鱼油大规模生产利用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

精制沙丁鱼油(酸价0.76%±0.05%) 浙江舟山奥旭鱼油制品有限公司;无水乙醇 分析纯,杭州双林化工试剂有限公司;氢氧化钠、正戊烷 分析纯,西陇化工股份有限公司;其他试剂均为分析纯。

RCT B S025型加热磁力搅拌器 艾卡(广州)仪器设备有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-3000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 乙酯化工艺 称取100 g精制沙丁鱼油于三口烧瓶中,置于加热磁力搅拌器中,预热达到一定的反应温度,将已完全溶解的一定量的NaOH-无水乙醇混合液缓慢加入鱼油中,在密闭条件下反应一定时间后,把反应溶液倒至分液漏斗中,分别加入100、50、50 mL的5%氯化钠热溶液清洗三次,静置2.0 h后,去除下层浊液,将上层清液置于圆底烧瓶中,旋转蒸发脱去乙醇和水,即得到粗乙酯化鱼油。将粗乙酯鱼油与同等体积的正戊烷混合完全,放置于-20 ℃冰箱中12 h;减压抽滤去除未反应的甘油三酯,滤液通过旋转蒸发除去正戊烷,即得到脂肪酸乙酯产品m[11]。按照以下公式计算乙酯率。

1.2.2 单因素实验设计 以无水乙醇用量、NaOH用量、反应时间、反应温度为单因素,以乙酯得率为指标,通过单因素实验选出鱼油乙酯化的最佳工艺范围。在温度为60 ℃,反应时间为60 min,NaOH用量为1.0 g条件下,研究不同的无水乙醇用量(30、40、50、60、70 g)对乙酯率的影响;在无水乙醇用量60 g,反应温度60 ℃条件下反应60 min,研究不同用量的NaOH催化剂(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 g)对乙酯率的影响;在无水乙醇用量60 g,NaOH用量1.0 g,反应温度60 ℃的条件下,研究不同反应时间(30、50、90、120、180 min)对乙酯率的影响;在无水乙醇用量60 g,NaOH用量1.0 g的条件下反应60 min,研究不同反应温度(40、50、60、70、80 ℃)对乙酯率的影响。

1.2.3 响应面实验设计 根据单因素试验结果,对无水乙醇用量、NaOH用量、反应时间与反应温度4因素3水平的29个组合进行鱼油乙酯化响应面试验,以乙酯率为响应值,试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3 数据处理

利用Origin Pro 8作图分析并借助Design-Expert.8.0进行响应面优化实验及数据分析。对样品进行三次平行测定,取平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素实验分析

2.1.1 无水乙醇用量对鱼油乙酯率的影响 由图1可以看出,鱼油乙酯率随着无水乙醇用量的增加,先增加后有稍微的降低。当无水乙醇用量为60 g时,乙酯率达到最大值,继续增加无水乙醇用量,对乙酯率的提高作用不大。乙酯化反应是一个可逆过程,过量的无水乙醇用量能推动反应向正反应方向进行,从而提高乙酯率[22],因此醇油摩尔比至少大于3∶1。但无水乙醇用量过大时,对于酯化效果的影响不明显,而且会稀释反应体系。趋于对乙酯化效果以及无水乙醇用量成本等因素的考量,无水乙醇用量应选取60 g。

图1 无水乙醇用量对乙酯率的影响Fig.1 Effect of C2H5OH content on the yield of ethyl esters

2.1.2 NaOH用量对鱼油乙酯率的影响 由图2可见,乙酯率随NaOH用量的增加,先提高后降低,且影响较大,在用量1.0 g时达到最大值。初始阶段,增加催化剂用量能促进反应向正反应方向进行,从而提高乙酯率。但催化剂添加量过多时,使得NaOH与甘油三酯发生皂化反应,反而降低了乙酯率[11]。因此,确定NaOH的最佳添加量为1.0 g。

图2 NaOH用量对乙酯率的影响Fig.2 Effect of NaOH content on the yield of ethyl esters

2.1.3 反应时间对鱼油乙酯率的影响 由图3可知,随着反应时间的增加,乙酯率先增加后降低,在反应时间60 min时达到最高峰。反应时间较短时,反应进行不充分,乙酯率较低。但随着时间的推移,反应体系中水和甘油的生成量逐渐增加,乙酯率达到一定值后,会促使反应向着逆方向进行,且若反应时间过长,可能会引起水解反应等副反应的发生,从而降低乙酯率。考虑到反应时间对乙酯率的影响,本试验选择60 min作为最佳反应时间。

图3 反应时间对乙酯率的影响Fig.3 Effect of reaction time on the yield of ethyl esters

2.1.4 反应温度对鱼油乙酯率的影响 乙醇的沸点是78.3 ℃,且鱼油在较高温度下易发生氧化,因此温度的选择应低于80 ℃。由图4可见,乙酯率在反应温度为50 ℃时达到最大值。温度升高,乙醇从液相中挥发的就越多,与反应物、催化剂的接触面减少,使得乙酯率下降。因此,在既节省能耗,又能使乙酯化反应充分的情况下,选择最佳反应温度50 ℃。

图4 反应温度对乙酯率的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the yield of ethyl esters

2.2 响应面优化试验分析

本实验以乙酯率为最终响应值,无水乙醇用量、NaOH用量、反应时间与反应温度4因素3水平的29个组合及相应的响应面试验结果如表2。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Experimental design and results of response surface

2.2.1 模型建立及显著性分析 应用Design Expert对试验数据进行多元回归拟合,得到精制沙丁鱼油乙酯率与各因素变量的回归方程为:

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面交互作用分析 根据回归方程,利用Design Expert软件绘制各因素间交互作用的响应面及等高线,如图5～图10所示。

图5 无水乙醇用量和NaOH用量对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface and contour of C2H5OH and NaOH content influenced the yield of ethyl esters

图6 无水乙醇用量和反应时间对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.6 Response surface and contour of C2H5OH content and reaction time influenced the yield of ethyl esters

图7 无水乙醇用量和反应温度对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.7 Response surface and contour of C2H5OH content and reaction temperature influenced the yield of ethyl esters

图8 NaOH用量和反应时间对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.8 Response surface and contour of NaOH content and reaction time influenced the yield of ethyl esters

图9 NaOH用量和反应温度对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.9 Response surface and contour of NaOH content and reaction temperature influenced the yield of ethyl esters

图10 反应时间和反应温度对乙酯率影响的响应面及等高线Fig.10 Response surface and contour of reaction time and temperature influenced the yield of ethyl esters

图5为反应时间60 min、反应温度50 ℃时,无水乙醇用量与NaOH用量及两者的交互作用对乙酯率的影响。NaOH用量相较于无水乙醇用量曲面更陡,且轴向等高线更密集,说明对乙酯率的影响更显著。由等高线图可知,两者的交互作用不强。

图6为NaOH用量1.0 g、反应温度50 ℃时,无水乙醇用量与反应时间及两者的交互作用对乙酯率的影响。反应时间的曲面坡度更陡,等高线沿轴向更密集,说明其对于乙酯率的影响较无水乙醇用量更显著。等高线图趋于椭圆形,表明两者的交互作用具有显著性影响(p<0.05)。

图7为NaOH用量1.0 g、反应时间60 min时,无水乙醇用量与反应温度及两者的交互作用对乙酯率的影响。当无水乙醇用量不变时,乙酯率随反应温度的升高先增大后减小;当保持反应温度不变时,亦有类似的趋势,其中增大趋势更为明显。根据等高线图可以看出,沿无水乙醇用量轴向更为密集,说明无水乙醇用量对乙酯率的影响较反应温度大。而等高线图趋于圆形,说明两者的交互作用不强,影响不显著。

图8为无水乙醇用量60 g、反应温度50 ℃时,NaOH用量与反应时间及两者的交互作用对乙酯率的影响。当NaOH用量不变时,乙酯率随反应时间的延长不断增大,但增幅逐渐减小;当反应时间不变时,乙酯率随NaOH用量的增加亦有同样的变化趋势,但其曲面更陡,说明NaOH用量对乙酯率的影响较反应时间更大,且NaOH用量与反应时间的交互作用对乙酯率的影响极显著(p<0.01)。

图9为无水乙醇用量60 g、反应时间60 min时,NaOH用量与反应温度及两者的交互作用对乙酯率的影响。当NaOH用量不变时,乙酯率随反应温度的升高,先增大后减小,曲面较缓;当反应温度保持不变时,乙酯率随NaOH用量的增加不断增大,增幅逐渐减小。等高线沿NaOH用量轴向较反应温度轴向更为密集,且趋于椭圆形,说明两者的交互作用较强(p<0.05)。

图10为无水乙醇用量60 g、NaOH用量1.0 g时,反应时间与反应温度及两者的交互作用对乙酯率的影响。当保持反应时间不变时,乙酯率随反应温度的升高先增大后减小,曲面比较缓和;当反应温度不变时,乙酯率随反应时间的加长而不断增大。等高线沿反应时间轴向较密集,而沿反应温度轴向较稀疏,说明反应时间对于乙酯率的影响更为显著,但反应时间与反应温度的交互作用对乙酯率的影响并不显著。

2.2.3 精制沙丁鱼油乙酯化工艺的优化与验证 根据回归模型,通过Design-Expert软件分析得到的精制沙丁鱼油乙酯化最优工艺为:无水乙醇用量61.10 g、NaOH用量1.20 g、反应时间75.00 min、反应温度50.32 ℃。在此工艺条件下,乙酯率的预测值为88.08%。考虑到实际操作的便利,将工艺条件修正为:无水乙醇用量60 g、NaOH用量1.2 g、反应时间75 min、反应温度50 ℃。以修正过的最优乙酯化工艺条件进行验证试验,平行三次取平均值,得到乙酯率88.12%±0.08%,近似预测值。

3 结论

在单因素实验基础上采用响应面分析法得到精制沙丁鱼油乙酯化最优工艺条件:无水乙醇用量60 g、NaOH用量1.2 g、反应时间75 min、反应温度50 ℃,乙酯率为88.12%±0.08%,与预测值相近。各因素对乙酯率的影响依次为:NaOH用量>反应时间>无水乙醇用量>反应温度。