林树乾 秦炳燕 冯敏燕 李桂明 杨世发 赵增成 傅剑 黄中利

摘要：為了解细菌抗药性的种间传递，本试验将抗药的鸭疫里默氏杆菌RA P3菌株和不抗药的大肠杆菌标准株8099混合传代培养，筛选传代培养后出现的大肠杆菌抗药菌株，之后对获得的抗药大肠杆菌菌株K-8099和大肠杆菌标准株8099及鸭疫里默氏杆菌RA P3菌株进行药敏试验和抗药基因检测。结果表明鸭疫里默氏杆菌RA P3的抗药基因传递给了不抗药的大肠杆菌标准株8099，且大肠杆菌抗药株K-8099的抗药水平显著提高。说明在混合感染过程中，鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌的的抗药性确实可以发生种间传递。

关键词：鸭疫里默氏杆菌；大肠杆菌；混合传代培养；抗药性传递

中图分类号：S852.61文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0027-06

Abstract In order to know the interspecific drug-resistance transfer of bacteria， RA P3 strain from Riemerella anatipestifer with drug-resistance and E.coli standard strain 8099 sensitive to the antibiotics were selected for mixed subculture to screen out the appeared E.coli strain with drug-resistance. Then， we tested the drug sensitive and resistance gene in E.coli strain K-8099 with drug-resistance from mixed subculture， E.coli standard strain 8099 and RA P3 strain in the study. The results showed that the resistance gene from RA P3 strain was transfered into E.coli standard strain 8099， and the drug-resistance of E.coli strain K-8099 was significant improved. This study proved that interspecific drug resistance transfer could really happen between Riemerella anatipestifer and E.coli in the mixed infection process.

Keywords Riemerella anatipestifer； Escherichia coli； Mixed subculture；Drug-resistance transfer

鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌均为严重危害鸭养殖业的主要病原菌[1]。鸭疫里默氏杆菌对2～8周龄雏鸭危害性最大，发病率为5%～90%，死亡率高达90%[2]。大肠杆菌是造成家禽养殖业经济损失最严重的病原体，也是禽肉加工中造成胴体报废的主要原因，仅因为大肠杆菌败血症导致的胴体报废率就达到43%[3]。大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌尽管有相似的形态，但属于不同科属，大肠杆菌为肠杆菌科大肠杆菌属，鸭疫里默氏杆菌先后被列入莫拉氏菌属、巴氏杆菌属，1993年Segers等根据培养特性、16S rRNA序列和表型，建议将其独立出来成为黄杆菌科下的鸭疫里默氏杆菌属[4]。这两种临床上常见的致病菌，常常出现混合感染、继发感染[5-7]。由于在养殖业中常常不合理地使用抗生素，这两种菌的抗药性和抗药谱不断扩大[8-11]。临床上虽然在药敏试验的基础上指导用药，但实际治疗效果往往不佳，这很可能是因为这两种菌混合感染时其各自不同的抗药性发生了种间传递，使得每种菌的抗药性都增加，抗菌谱扩大，导致治疗失败。本研究将不抗药的大肠杆菌菌株与抗药的鸭疫里默氏杆菌菌株共同传代培养，检验是否能筛选出抗药大肠杆菌菌株，以期为细菌抗药性的种间传递提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

鸭疫里默氏杆菌抗药菌株（RA P3）是本实验室从2014年山东地区鸭疫里默氏杆菌病死鸭的肝脏中分离所得；大肠杆菌标准株8099（EC 8099），购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Power Taq PCR MasterMix、6×Loading Buffer、50×TAE电泳缓冲液（pH8.5），购自北京百泰克生物技术有限公司； DL2000 DNA Marker，购自北京天根生物技术有限公司；Regvlar Agarose G-10，购自Biowest公司；庆大霉素标准品、妥布霉素标准品、阿米卡星标准品、环丙沙星标准品、氧氟沙星标准品、诺氟沙星标准品，均购自中国药品生物制品检定所；药敏试纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 仪器

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DHP-500电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂）；数显气浴恒温振荡器（常州普天仪器制造有限公司）；JHT-系列净化工作台（济南洁康净化设备厂）； 311型 CO2 培养箱（Thermo Fisher）；PCR扩增仪；GenoSens 1800系列凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 RA P3和EC8099菌株的药敏试验 采用药敏试纸片法（K-B法）[12]进行RA P3和EC 8099对3种氨基糖苷类（妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星）和3种喹诺酮类（氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星）共6种抗生素的药敏试验。取游标卡尺准确测量抑菌圈直径，以没有明显肉眼可见物区域为抑菌圈边缘。试验时大肠杆菌接种在普通营养琼脂中，鸭疫里默氏杆菌接种在含4%血清的TSA琼脂中。

1.4.2 鴨疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养 按照李翠等[13]的方法对RA P3和EC 8099进行体外混合传代培养。第一代将5 μL用含4%血清的TSA培养基活化培养24 h的RA P3菌液接种到4 mL含4%血清的TSB 培养基中，37℃摇床培养14～18 h，刚见浑浊时，再将活化的5 μL大肠杆菌菌液加入到上述培养基中，继续同样条件混合培养12 h。以后各代除了用5 μL上一代混合培养12 h的菌液代替活化的5 μL大肠杆菌菌液外，其它程序和接种培养条件同第一代。共传代50次。每一代皆吸取100 μL混合培养菌液，涂布于含4%血清的TSA平板，置CO2恒温培养箱37℃培养9～12 h，观察两种菌的生长情况。

1.4.3 筛选抗药性大肠杆菌菌株 每一次混合传代培养12 h后，皆吸取100 μL混合培养菌液，分别涂布于含庆大霉素（4 μg/mL）、妥布霉素（4 μg/mL）、阿米卡星（16 μg/mL）、氧氟沙星（0.5 μg/mL）、环丙沙星（0.5 μg/mL）、诺氟沙星（1 μg/mL）的麦康凯抗性筛选板，置CO2恒温培养箱37℃培养20～24 h。由于鸭疫里默氏杆菌在麦康凯平板上不生长，所以在麦康凯抗性板上生长的菌株即为抗药的大肠杆菌菌株。上述各筛选板所含抗生素浓度，为欧洲药敏试验联合委员会（EUCAST）2017欧盟药敏试验标准所列出的大肠杆菌对抗生素的耐受折点值。

1.4.4 抗药大肠杆菌与EC 8099药敏试验的比较 先挑取在麦康凯抗性板上生长的菌落进行纯化培养，之后利用药敏试纸片法（K-B法）进行抗药大肠杆菌与EC 8099对3种氨基糖苷类（妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星）和3种喹诺酮类（氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星）共6种抗生素的对比药敏试验。

1.4.5 抗药大肠杆菌与EC 8099最低抑菌浓度的比较 根据药敏试验结果，采用试管双倍稀释法[12]，对EC 8099及抗药大肠杆菌进行抗生素最低抑菌浓度（MIC）检测。

1.4.6 抗药基因检测 上述试验筛选得到的抗药大肠杆菌耐受氨基糖苷类药物，所以选取论文中已发表的氨基糖苷乙酰转移酶基因aac6-Ⅰ[14]及aac3-Ⅱ[15]、氨基糖苷腺苷转移酶基因aadA1[16]、氨基糖苷磷酸转移酶基因aph（3′）-Ⅲ [17]的引物序列（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。通过PCR检测RA P3、EC 8099及混合传代后筛选到的抗药大肠杆菌有无抗药基因。各基因引物序列见表1。

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取RA P3、EC 8099及混合传代后筛选到的抗药大肠杆菌的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系见表2。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃再延伸10 min。PCR扩增结束后的产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 RA P3和EC 8099药敏测定结果

从表3可以看出，RA P3耐受这6种抗生素；而根据EUCAST 2017欧盟药敏试验标准，EC 8099对这6种抗生素皆敏感。

2.2 混合传代培养

混合培养过程中，基本每一代都能得到如图1所示的培养结果，奶油状透明的小菌落为鸭疫里默氏杆菌，白色大菌落为大肠杆菌，两者的菌落数量大体一致。

2.3 抗药大肠杆菌筛选结果

在混合传代培养后筛选抗药菌株过程中，含环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的麦康凯抗性板上一直无菌落出现；含阿米卡星的麦康凯抗性板上在27代有单个菌落，含庆大霉素的麦康凯抗性板上36代有多个菌落，含妥布霉素的麦康凯抗性板上在37代有3个菌落（图2）。挑取各个抗性板上的单个菌落继续在相应抗性的麦康凯抗性板上传代，仅第27代筛选得到的抗药菌株可以在含阿米卡星抗性板上稳定生长，命名为大肠杆菌K-8099（EC K-8099）。

2.4 EC 8099与EC K-8099药敏试验结果比较

从图3、4可以直观看出，EC K-8099菌株获得对3种氨基糖苷类抗生素的抗药性，但仍然不耐受3种喹诺酮类药物。

2.5 EC 8099与EC K-8099最低抑菌浓度的比较

从表4可以看出，EC K-8099对三种氨基糖苷类抗生素的MIC显著高于EC 8099。

2.6 抗药基因检测

如图5、6所示，从RA P3菌株及大肠杆菌抗药菌株K-8099检测到了一条486 bp的条带，为aac6-Ⅰ基因，但未检测到其他基因。大肠杆菌标准株8099未检测到任何抗药基因。

3 讨论与结论

随着全球细菌抗药性问题越来越严重，人们一直在研究探索抗药性产生的机理。目前认为细菌的抗药性来源包括两个途径：一个是细菌自身基因突变产生新的抗药基因。这种突变主要发生于染色体DNA，质粒DNA或转座子DNA也可发生，而且除结构基因外的某些调节基因突变也可导致细菌抗药性的产生。但这类自发突变的机率很小，约为 10-6～10-8，更多的是由理化因素诱发突变而产生抗药基因。由于在不稳定的环境因素选择下，细菌通常很难形成稳定的抗药性菌株，因此，自身基因突变并不是造成如今细菌抗药局面的主要原因[18]。捕获外源抗药基因是细菌获得抗药性的另一个重要途径。外源性抗药基因可以位于其染色体片段上，也可由质粒携带[19]。在外界环境诱导下，质粒携带的这些可移动的遗传因子可在不同的种属间传递；还可通过转座子[20，21]或整合子/基因盒[22-25]将位于染色体上的抗药基因进行种属间传递，引起遗传信息重新排列。这样不但传递了抗药性，而且更容易产生多重抗药菌株。细菌由这种捕获方式获得抗药性的机率高，是引起抗药性的主要原因[26，27]。

鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌的培养条件相差很大，使用同一种培养基培养两种菌，若大肠杆菌具有生长优势，则会抑制鸭疫里默氏杆菌的生长。本实验室通过多次摸索，首先确定了在连续传代情况下两种菌能共同生长的培养条件，并建立了體外混合培养及重新分离这两种细菌的方法[13]。

筛选抗药性大肠杆菌试验中，在庆大霉素、妥布霉素及阿米卡星麦康凯抗性板上均筛选到了单个菌落；让这些单个菌落继续在相应抗性板上传代，其中仅阿米卡星抗性板上的菌落能稳定遗传。说明捕获的抗药性，未必能稳定遗传。

本试验结果表明，筛选获得的大肠杆菌抗药菌株K-8099获得了氨基糖苷乙酰转移酶基因aac6-Ⅰ，且对氨基糖苷类的妥布霉素、庆大霉素和阿米卡星的最低抑菌浓度较大肠杆菌标准株8099显著增加。氨基糖苷乙酰转移酶基因aac6-Ⅰ基因存在于RA P3菌株的染色体DNA中，而在大肠杆菌标准株8099中未检测到，由此判断该抗药基因是由鸭疫里默氏杆菌向大肠杆菌传递而来，可能是通过转座子或者整合子在这两种不同种属的细菌间进行基因传递。

参 考 文 献：

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