邹慧云 赵凌 李玉波 荆楠楠 刘芸斐 夏慧禹 李学文

摘要：利用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）的方法检测山东省集约化蔬菜种植区不同蔬菜中3种喹诺酮类抗生素（诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星）的含量，探讨蔬菜中抗生素残留出现空间差异的原因，并采用每日估计摄入量（EDI）/每日允许摄入量（ADI）评价蔬菜中喹诺酮类抗生素对人体健康的风险。结果表明，该地区蔬菜中喹诺酮类抗生素的残留较为严重，总含量为18～661 μg/kg，平均值为161.07 μg/kg，诺氟沙星的检出率为100%，环丙沙星和恩诺沙星的检出率分别为26.15%、33.85%。蔬菜中的喹诺酮类抗生素浓度出现空间差异性，即南部地区的蔬菜中抗生素浓度普遍高于北部地区。蔬菜种类和大棚类型是蔬菜中喹诺酮类浓度空间差异的主要影响因素；菠菜和香菜中的抗生素暴露对儿童存在潜在的健康风险，需引起种植业和养殖业相关部门的高度重视。

关键词：蔬菜； 集约化种植；喹诺酮类； 抗生素残留； 健康风险

中图分类号：S859.79+6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0032-06

Abstract Three quinolone antibiotics （norfloxacin， ciprofloxacin and enrofloxacin） in vegetables from intensive vegetable cultivation areas of Shandong Province were determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）. The reasons causing spatial difference of antibiotic residues in vegetables were analyzed and their potential risk to human health was evaluated by comparing daily estimated intake （EDI）/acceptable daily intake （ADI）. The results showed that the residues of quinolones in vegetables were very serious， and the total content was 18～661 μg/kg with the average value of 161.07 μg/kg. The detection rate of norfloxacin， ciprofloxacin and enrofloxacin were 100%， 26.15% and 33.85%， respectively. The concentration of quinolone antibiotics in vegetables showed spatial differences， and that in the southern region was generally higher than that in the northern region. Vegetable and greenhouse types were the main factors influencing the spatial differences of quinolone concentration in vegetables. Antibiotic exposure in spinach and parsley had potential health risk for children， which should attach great importance of relevant departments of the planting and breeding industry.

Keywords Vegetable； Quinolones； Antibiotic residue； Health risk

抗生素耐藥是全球关注的公共卫生问题，抗生素滥用是造成耐药菌在环境中传播的主要原因之一[1]。抗生素除了用于临床治疗，也广泛用于动物、农业及食品等领域。中国是世界上最大的抗生素生产和使用国，2013年中国消耗约92 700吨抗生素，其中超过46%的抗生素用于动物养殖业[2]。进入动物体内的抗生素不能被完全代谢吸收，约60%～90%[3，4]以原形通过粪便和尿液排出体外进入环境，因此，动物粪便可残留多种抗生素[5，6]。

有机蔬菜的生产需要施用有机肥，畜禽粪便常作为重要有机肥源被大量施入大棚土壤。抗生素随畜禽粪便进入土壤后，向下迁移渗入地下水，或被蔬菜吸收富集[7]。大量研究表明蔬菜中也存在多种抗生素[8-10]，畜禽粪肥是唯一的抗生素来源，因此粪肥施用导致蔬菜中抗生素残留的种类差异及其空间差异的深层次原因值得探究。

另外，蔬菜残留的抗生素通过食物链进入人体，可能引起胃肠道菌群结构失调和功能紊乱，也可能对人体中的微生物耐药性进行选择和诱导，促进耐药菌和耐药基因的发展和传播[11，12]。喹诺酮类抗生素在土壤、蔬菜中检出的含量和种类较多[13]，土壤对其吸附能力也大于磺胺类和大环内酯类抗生素。此外，某些喹诺酮类抗生素进入环境后，其代谢物毒性比抗生素母体更强，甚至转化成抗生素原药[14]。因此，集约化种植区蔬菜中喹诺酮类抗生素的残留对人体的健康风险需要明确。

综上，本研究在检测集约化种植区不同种类蔬菜中喹诺酮类抗生素残留情况的基础上，探讨蔬菜中抗生素残留出现空间差异的原因，并评估蔬菜中的抗生素残留对人体潜在的健康风险，以期为降低蔬菜中抗生素残留提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星购自美国Sigma公司，纯度均在98.0%以上；乙腈和甲醇（HPLC级）购自美国Fisher公司；通过Milli-Q系统制备超纯水；亲水亲脂平衡萃取柱（Oasis HLB）（200 mg，6 mL）；其他试剂均为分析纯。

1.2 样品采集

根据随机抽样原则，从山东省集约化蔬菜种植基地共采集65个蔬菜样本（图1），包括辣椒、菠菜、黄瓜、茄子、茼蒿、油菜、番茄、香菜和生菜。蔬菜种植在面积约500～1 000 m2的大棚内，一年种植两至三季，使用鸡粪（包括鲜鸡粪、稻壳鸡粪、发酵鸡粪）作为有机肥料。本研究采集蔬菜可食用部分于塑料袋中，保存于-4℃冰盒内，待样本全部收集完毕（1～3 h）后立即送到实验室冻干保存。

1.3 抗生素残留分析

样品处理：将冻干的蔬菜1.0 g均质化后置于离心管中，加入10 mL乙腈和盐酸萃取剂（V∶V=125∶1），超声辅助萃取15 min，待自然冷却后，4 000 r/min离心10 min，将萃取后的上清液置于棕色瓶中，再重复提取3次后，合并上清液于棕色瓶，之后加入20 mL正己烷，利用液-液萃取技术去除脂类物质。连接HLB 小柱，依次用5 mL甲醇与5 mL超纯水活化小柱。将除去脂类物质的上清液以3 mL/min的速度过HLB柱后，用10 mL超纯水淋洗HLB柱，洗除杂质。将HLB小柱冻干，除去多余水分，用6 mL甲醇洗脱HLB柱，流出液收集于10 mL棕色瓶中。氮气吹干，复溶于1 mL甲醇-水溶液（V∶V=1∶1），充分振荡1 min，过直径为0.22 μm的有机滤膜，通过HPLC-MS方法检测目标抗生素诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的浓度。

检测条件：色谱柱为XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相为0.1%甲酸溶液和乙腈；柱温为20℃；进样量10 μL。离子源为电喷雾电离（ESI）；扫描方式为正离子扫描；监测模式为多反应监测模式（MRM）；毛细管电脉压为3 000 V；雾化器压力为30 206.85 kPa；干燥气体为氮气；干燥气体的流量和温度为10 L/min和350℃。

1.4 蔬菜消耗导致的健康风险评估

蔬菜消耗导致的健康风险是根据EDI与ADI的比值来计算的，ADI是指人或动物每日摄入某种化学物质对健康无任何已知不良效应的剂量；EDI是指从蔬菜消耗中每人（包括成人和儿童）的抗生素估计摄入量，其计算公式具体如下：

式中：Cfood代表某种抗生素在蔬菜中的平均浓度（干重），ng/g；IRveg代表中国成年人每人每天3.45杯的蔬菜，儿童每人每天2.86杯的蔬菜[8，15]；βg/cup表示一杯新鲜蔬菜的质量，将蔬菜的可食部分切成体积≤0.5 cm3的颗粒后置于杯中，待填满后称取蔬菜的重量（湿重），g；βww/dw代表美国环保局在开发土壤筛选值时使用的植物组织平均干湿转换因子（0.085）[8]；BW是指儿童或成人的体重，kg。

通过EDI与ADI的比值（即危害值）评估由蔬菜消耗而导致的抗生素暴露对人体的潜在健康风险[16，17]。当EDI/ADI>0.1时，可认为因蔬菜消耗而导致的抗生素暴露对人体健康存在潜在风险。

1.5 数据统计分析

利用IBM SPSS 23.0软件对抗生素残留相关的可疑因素进行描述性分析，通过K-S检验来获知样本的分布进而探讨蔬菜中抗生素含量空间差异的影响因素分析，利用克里金插值法通过ArcGIS软件对蔬菜中喹诺酮类抗生素含量的空间分布进行分析。

2 结果与分析

2.1 喹诺酮类抗生素的检出情况

表1表明，诺氟沙星的检出率为100%，含量均值为147.09 μg/kg；恩诺沙星和环丙沙星含量的均值分别为8.11、5.87 μg/kg，检出率分别为33.85%和26.15%。从蔬菜种类来看，菠菜、香菜、辣椒和茄子中诺氟沙星含量较高，其均值分别为410.76、368.66、210.51、204.67 μg/kg；香菜中检出的环丙沙星和恩诺沙星含量最高，分别为38.41 μg/kg和35.93 μg/kg，而生菜中未检测到环丙沙星和恩诺沙星，油菜中未检测到环丙沙星（低于检出限）。另外，环丙沙星和恩诺沙星的变异系数分别为1.89、1.48，表明不同种类的蔬菜中环丙沙星和恩诺沙星含量差别较大。

2.2 喹诺酮类抗生素的空间分布

蔬菜中喹诺酮类抗生素总量表现出一定程度的空间差异性，即喹诺酮类抗生素在南部地区的浓度要高于北部地区，且大于150 μg/kg。诺氟沙星与喹诺酮类抗生素总量的空间分布趋势基本一致，表现为在南部地区蔬菜中检出的浓度最高，在西北地区浓度最低（< 100 μg/kg）。环丙沙星和恩诺沙星在蔬菜中的浓度远低于诺氟沙星，两者均在东南方向较高（图2）。

2.3 喹诺酮类抗生素浓度空间差异的影响因素分析

将喹诺酮类抗生素浓度作为研究的结局变量，经过K-S正态性检验发现喹诺酮类抗生素浓度分布为非正态分布，将蔬菜中抗生素残留的可疑因素，包括鸡粪类型（鲜鸡粪/干鸡粪/混合鸡粪）、鸡粪单位用量、蔬菜大棚面积、蔬菜大棚类型（日光/拱棚）和蔬菜种类等，依次进行Kruskal-Wallis检验，其统计结果显示，不同种类的蔬菜以及不同类型的蔬菜大棚中喹诺酮类抗生素浓度差异显著（P<0.05），即蔬菜种类和大棚类型是蔬菜中喹诺酮类抗生素浓度空间差异的影响因素，其中菠菜、香菜、茄子和辣椒中喹诺酮类抗生素的含量较高，生菜与番茄含量较低；使用拱棚种植蔬菜的喹诺酮类抗生素浓度比日光温室中高。

2.4 蔬菜消耗导致的健康风险评估

表2所示，当消耗同种类的蔬菜时，儿童暴露于某种抗生素导致的健康风险约是成人的3倍；当消耗不同种类的蔬菜时，人群暴露于某种抗生素所导致的健康风险不同。另外，消耗同种蔬菜时，由诺氟沙星暴露所导致的健康风险是环丙沙星和恩诺沙星的10倍之多，菠菜和香菜中诺氟沙星的残留对儿童可能造成健康风险（EDI/ADI>0.1）；蔬菜中环丙沙星和恩诺沙星的残留对人群无健康风险（EDI/ADI<0.1）。

3 讨论

本研究蔬菜中喹诺酮类抗生素残留较严重，高于在上海市崇明岛养殖场周边蔬菜中检出的量（总含量<110 μg/kg，平均值为21.9 μg/kg）[18]。本研究中诺氟沙星的检出率为100%，平均含量为147.09 μg/kg，高于东莞市蔬菜基地的蔬菜中诺氟沙星检出情况（检出率为80%，平均含量为19.85 μg/kg），但环丙沙星和恩诺沙星的检出情况均低于东莞基地蔬菜中的检出情况[19]。不同地区蔬菜中喹诺酮类含量与粪肥类型、灌溉条件、施肥量、施肥频率和产地环境质量等有关，陈志宇等[20]发现鸡粪中抗生素含量高于猪粪和牛粪，赵晶等[18]发现猪粪、鸡粪中的喹诺酮含量高于牛粪；此外，灌溉水对蔬菜中喹诺酮类抗生素的含量影响也较大，本研究的蔬菜种植区主要以井水灌溉，區别于其他蔬菜种植区的养殖废水、水库水和河流水等。

不同种类蔬菜中喹诺酮类抗生素含量存在显著差异（P<0.05）。菠菜、香菜、辣椒、茄子中诺氟沙星的平均含量均大于200 μg/kg，分别为410.76、368.66、210.51、 204.67 μg/kg，茼蒿、油菜和黄瓜中的平均含量在100～200 μg/kg之间，而番茄和生菜中的平均含量均小于100 μg/kg。不同种类蔬菜中抗生素含量差异可能由诸多因素造成，Li等[21]研究发现不同类型蔬菜的抗生素富集系数不同，茄果类蔬菜抗生素富集系数大于叶菜类，从而导致茄果类抗生素含量高于叶菜类，这与本研究结果基本一致。另外，蔬菜对抗生素的积累能力，主要取决于蔬菜生长期、土壤性质和土壤肥力等因素。

近期，一项监测江浙沪地区1 000名儿童的抗生素暴露研究发现，至少有58%的儿童尿液能检出1种抗生素，甚至有的尿样可检出6 种抗生素。儿童体内的兽用抗生素来源除了水、牛奶、食用肉等[22]，蔬菜也是来源之一。通过对不同种类的蔬菜进行健康风险评估发现，菠菜和香菜对儿童可能造成健康风险。儿童早期暴露抗生素可能导致体重增加，诱发湿疹、哮喘等[23]。另外，婴幼儿和低龄儿童暴露于抗生素环境诱导的耐药菌风险显著高于一般人群。

如何降低蔬菜中抗生素的残留是当前食品安全领域面临的重要挑战。需要从源头进行控制，一方面，养殖业需合理使用抗生素，以减少畜禽粪便中的抗生素残留；另一方面，种植业需合理施用畜禽粪肥，减少畜禽粪肥施用量，且尽量施用发酵过的粪肥，以减少抗生素残留对温室土壤的污染。

4 结论

山东省集约化蔬菜种植区蔬菜中残留的喹诺酮类抗生素以诺氟沙星为主，其残留的平均含量是环丙沙星的18倍，恩诺沙星的24倍，且不同种植区的蔬菜及同一种植区不同种类的蔬菜中喹诺酮类含量存在差异；蔬菜中的喹诺酮类抗生素浓度表现出一定程度的空间差异性，蔬菜种类和大棚类型是空间差异产生的主要原因。菠菜、香菜中诺氟沙星的残留可能对儿童造成健康风险，需引起相关部门的高度重视。

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