鲁文杰+张新爱+李昌烽+申建忠+蒋玉香+黄陈勇

摘要 利用树枝状分子-金纳米粒子复合物修饰电极和金纳米粒子标记物构建电化学免疫传感器，用于污泥中大肠杆菌的检测。首先在玻碳电极表面电聚合对氨基苯甲酸，通过共价作用结合第Ⅳ代氨基末端的树枝状分子（G4-PAMAM），并在其内部载入金纳米粒子，制备修饰电极（GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）），用于固定大肠杆菌。采用硫堇作为电活性物质包被金纳米粒子，用于标记二抗制备金纳米粒子标记物（Ab2-Au-Th）。通过抗原-抗体之间的特异性识别作用，将一抗、金纳米粒子标记物依次修饰在电极表面，用差分脉冲伏安法测定硫堇产生的电流信号，实现对大肠杆菌的检测。在优化的实验条件下，响应电流与大肠杆菌浓度的对数在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范围内呈线性关系，检出限为70 cfu/mL（S/N=3）。利用本方法检测污水处理厂的不同污泥样品中的大肠杆菌，回收率为89.4%～105.8%。

关键词 城市污泥； 大肠杆菌； 树枝状分子； 功能化金纳米粒子； 电化学免疫传感

2016-01-10收稿；2016-04-11接受

本文系国家自然科学基金项目（Nos. 21205051， 11072091）和教育部科学技术重点研究项目（No.210078）资助

E-mail： zhangxinai@mail.ujs.edu.cn； cfli@ujs.edu.cn

1 引 言

随着我国城市污水处理进程的全面推进，污泥的产量与日俱增，给自然环境带来了沉重负担。因此，污泥的合理回收利用显得尤为重要[1，2]。然而，城市污泥成分复杂、微生物含量高，如果处置不当极易造成二次污染，特别是含有的病源微生物严重制约了污泥的有效利用[3～5]。污泥中病源微生物的危害与大肠杆菌（E. coli）的数量呈现一定的相关性[6]，因此大肠杆菌已经成为评估污泥回收利用可行性的重要指标，并被列为污泥微生物标准的必检项目。目前，大肠杆菌的常规检测方法主要有多管发酵法、滤膜法、稀释平板计数法等[7～9]，但存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，不能满足大肠杆菌快速检测的需求。因此，建立污泥中大肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测方法， 对评估污泥综合利用的可行性具有重要的现实意义。

电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、响应速度快和操作简单等优点，在大肠杆菌检测中呈现出良好的应用前景[10，11]。在电化学传感器制备中，如何提高电极的导电性能和增大电活性物质的固载量，从而实现信号放大是关键[12～16]。树枝状分子由于其特殊的结构能够封装金属络合物、金属纳米粒子或有机和无机的客体分子而备受关注[17～20]。其中，树枝状分子-金纳米粒子复合物兼具树枝状分子的表面活性和金纳米粒子独特的物理化学性质，既能增强树枝状分子的导电性，又能有效控制金纳米粒子的尺寸。本研究基于双重信号放大策略，利用树枝状分子-金纳米粒子复合物修饰电极和硫堇包被金纳米粒子标记二抗构建电化学免疫传感器，用于污泥中大肠杆菌的测定，为污泥中大肠杆菌的检测研究提供了新思路。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI 660d 型电化学工作站（上海辰华仪器公司），采用三电极体系：以玻碳电极（GCE，Φ=3 mm）为基底的免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极； JEM-2100透射电子显微镜（日本JEOL公司）； Cary 500紫外-可见分光光度计（美国Agilent公司）； Nicolet Nexus 670傅立叶红外光谱仪（美国Thermo Nicolet公司）。

G4-PAMAM树枝状分子、硫堇（Th）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）购于Sigma-Aldrich 公司； 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、硼氢化钠（NaBH4）、对氨基苯甲酸（p-ABA）、戊二醛（GA）购于国药集团化学试剂公司。兔抗大肠杆菌（DH5α）多克隆抗体（一抗，Ab1）、羊抗兔IgG（二抗，Ab2）由北京宝赛生物科技有限公司提供。10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液（PBS，pH 7.4），含136.7 mmol/L NaCl，2.70 mmol/L KCl。大肠杆菌菌种（DH5α）由江苏大学食品与生物工程学院提供。所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（>18.2 MΩ·cm）。所有玻璃容器在使用前均高压灭菌消毒。污泥实际样品取自于镇江市某污水处理厂。

2.2 Ab2-Au-Th标记物的制备

采用柠檬酸钠还原氯金酸制备金纳米粒子（AuNPs）[21，22]。将30 mL金纳米粒子溶液与6.0 mL饱和硫堇水溶液混匀，室温下搅拌24 h， 15000 r/min离心10 min，得到硫堇包被金纳米粒子沉淀（Au-Th）[23]； 用超纯水清洗沉淀，分散于4 mL PBS中。加入50 μL 二抗，在搅拌条件下孵育4 h，制得Ab2-Au-Th标记物。5000 r/min离心12 min，弃去未结合的检测抗体和副产物，用PBS重悬Ab2-Au-Th，于4℃保存备用。Ab2-Au-Th标记物的制备过程如图1（底部）所示。

2.3 免疫传感器的制备以及大肠杆菌的固定

玻碳电极用Al2O3抛光至镜面，依次用丙酮、1.0 mol/L HNO3、1.0 mol/L NaOH及超纯水超声清洗5 min。将电极用氮气吹干，放入5 mmol/L p-ABA溶液中，以50 mV/s扫速，在0～1.0 V间循环伏安扫描15圈，使电极表面羧基化，得到修饰电极（GCE/p-ABA）。清洗电极后，滴加10 μL含有EDC/NHS（400 mmol/L/100 mmol/L）的PBS溶液活化电极表面60 min。然后，在电极表面滴加10 μL PAMAM，使其氨基与电极表面的羧基反应60 min，制得GCE/p-ABA/PAMAM。将电极用二次蒸馏水清洗并吹干后，插入100 μL 0.1 mmol/L HAuCl4溶液中静置60 min后，取出并用二次蒸馏水清洗除去多余的HAuCl4。将修饰电极浸入新配制的1.0 mol/L NaBH4溶液中放置30 min，取出用二次蒸馏水清洗，制得GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）。滴加10 μL 0.25%GA溶液活化电极表面60 min，然后将修饰电极插入一定浓度的大肠杆菌溶液，37℃培养60 min，制备GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）/E. coli。在电极表面滴加10 μL 1% BSA孵育30 min用于封闭活性位点。将修饰电极用PBS清洗并吹干后，滴涂10 μL Ab1，37℃条件下孵育60 min。然后将10 μL Ab2-Au-Th滴涂于电极表面，孵育60 min，用PBS清洗后，进行电化学检测。

2.4 电化学检测

修饰电极的制备过程采用电化学交流阻抗（EIS）进行表征：应用电位0.20 V，振幅0.05 V，频率为0.10～100 kHz，静置时间2 s。

大肠杆菌的测定采用差分脉冲伏安（DPV）法，在乙酸缓冲液中进行，电位扫描范围为0～ 0.70 V，扫描速度50 mV/s，振幅0.05 V。通过测定电极表面固定的硫堇的响应电流实现对大肠杆菌的检测。所有测定均在室温下进行。免疫传感器的制备及大肠杆菌的检测过程如图1所示。

3 结果与讨论

3.1 Ab2-Au-Th标记物的表征

金纳米粒子从透射电镜（TEM）可见，金纳米粒子（图2A）呈球形，大小均匀，平均粒径为20 nm。包被硫堇后，金纳米粒子的粒径变大， 且呈现小的团簇（图2B），这是由硫堇的正电荷和金纳米粒子表面的负电荷相互作用引起的。从图2C的紫外-可见吸收光谱可见，金纳米粒子在520 nm处呈现明显的吸收峰（曲线a），硫堇在598和565 nm处有两个吸收峰，分别是硫堇单聚体和二聚体的特征峰（曲线b

）。当硫堇包被金纳米粒子后，由于硫堇分子之间强的电子耦合效应，565 nm处的吸收峰略微蓝移（曲线c）。当硫堇包被金纳米粒子并固载抗体后， 283 nm处的吸收峰发生红移（曲线d），这是由于硫堇的吸收峰与抗体的吸收峰相互重叠造成的。

3.2 树枝状分子固载金纳米粒子前后的红外光谱表征

图3是树枝状分子和树枝状分子固载金纳米粒子的红外光谱图。由谱线a可见，树枝状分子红外吸收中有明显的酰胺I带和酰胺II带，分别位于1640 和 1558 cm1处。谱线b与谱线a相比，酰胺I带和酰胺II带均分裂成双谱带，表明金纳米粒子的存在对酰胺键有明显干扰，证明金纳米粒子已成功载入树枝状分子 [24～27]。

3.3 不同修饰电极的电化学阻抗行为

以Fe（CN）3 6为氧化还原探针，采用交流阻抗法（EIS）考察工作电极界面的变化，如图4所示，其中高频部分的半圆直径对应于电子传递阻抗（Rct）。裸玻碳电极的Rct值约为180 Ω（曲线a）； 电聚合对氨基苯甲酸后， Rct值变大，表明对氨基苯甲酸成功修饰到电极表面并阻碍电子传递（曲线b）； 从曲线c可以看出，树枝状分子修饰电极后，电极Rct值明显下降，这可能是由于修饰在电极表面的氨基对溶液中Fe（CN）3 6产生一定的静电吸附，加快了电子转移速度所致； 当金纳米粒子载入树枝状分子形成GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）后， Rct值进一步降低，这是由于金纳米粒子大大增加了电极的导电性（曲线d）； 当大肠杆菌结合在电极表面后，由于大肠杆菌作为非导电性物质阻碍了电子的传递，Rct值明显增大（曲线e）； 依次修饰一抗与Ab2-Au-Th，Rct值逐步增大（曲线f和g）。

3.4 大肠杆菌测定条件的优化

考察了免疫反应时间对电流信号的影响，结果表明，随着免疫反应时间的增加，电流信号逐渐增强，60 min时趋于稳定，因此选择60 min作为免疫反应时间。考察了免疫反应温度在20～45℃范围高于37℃，信号开始下降，这可能是因为在高温时生物分子的活性降低，因此选择37℃作为免疫反应的温度。

3.5 免疫传感器的性能比较

分别采用GCE/p-ABA/PAMAM和GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）为基底的电化学免疫传感器，用于检测大肠杆菌（1.0×106 cfu/mL）。从图5可见，GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）为基底的免疫传感器的检测电流信号（曲线b）明显高于GCE/p-ABA/PAMAM为基底的免疫传感器的电流信号（曲线a），这是因为GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）具有较大的比表面积和优良的电化学性能，既增加了大肠杆菌的固载量，又提高了电子的转移速度。

3.6 传感器的标准曲线及检出限

在优化的实验条件下，采用本方法检测不同浓度的大肠杆菌标准溶液。图6是DPV响应电流随大肠杆菌浓度的变化图。响应电流与大肠杆菌浓度的对数在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范围内呈线性关系（图6插图），线性回归方程为Y（μA）= 0.1022+0.6144lgX（cfu/mL）（R2=0.9860， n=5），检出限为70 cfu/mL（S/N=3）。

3.7 传感器的特异性和重现性研究

污泥中其它微生物，如枯草杆菌、放线菌和酵母菌等， 对大肠杆菌的测定可能产生影响。1.0×104 cfu/mL大肠杆菌产生的响应电流信号为2.45 μA； 在该大肠杆菌溶液中分别加入1.0×104 cfu/mL枯草杆菌、放线菌和酵母菌，检测大肠杆菌产生的响应电流信号分别为2.38， 2.52 和2.49 μA，电流的偏差分别为2.68%， 2.68%， 1.63%，表明其它微生物的存在对大肠杆菌的测定无明显影响，证明传感器具有较高的特异性。

对4个浓度的大肠杆菌（1.0×102，5.0×102，1.0×103和5.0×103 cfu/mL）分别测定5次，所测得浓度的批内相对标准偏差（RSD）为6.2%，5.8%，7.0%和6.5%，批间RSD为4.9%，6.8%，5.4%和7.2%，表明本方法具有较好的重现性。

3.8 样品分析

对污水处理厂3个不同工序的污泥进行取样，采用本方法进行大肠杆菌检测，结果如表1所示。本方法与平板计数法[28]的相对误差在±8%以内，回收率为89.4%～105.8%，表明建立的电化学免疫分析方法用于污水处理厂实际样品中大肠杆菌的检测具有可靠性好、准确度高等优点。与文献[2，8～11]相比，本方法采用树枝状分子-金纳米粒子复合物来实现信号放大，为污泥中大肠杆菌的检测提供了新的思路。

4 结 论

利用树枝状分子-金纳米粒子复合物修饰电极和硫堇包被金纳米粒子标记抗体构建了一种用于污泥中大肠杆菌检测的电化学免疫传感器。树枝状分子和金纳米粒子提高了电极的导电性能，增大了电活性物质的固载量，从而实现信号放大。与常规的大肠杆菌检测方法相比，本传感器具有检测时间短、灵敏度高、选择性好的特点。污水处理厂实际样品的加标回收实验结果表明，本方法具有较好的应用前景。

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Abstract A novel electrochemical immunosensor was developed for detection of E. coli in urban sludge based on dendrimer-encapsulated Au and enhanced gold nanoparticle labels. p-Aminobenzoic acid （p-ABA） was electropolymerized on glassy carbon electrode （GCE） surface to introduce abundant carboxyl groups. G4-polyamidoamine dendrimers （PAMAM） were covalently attached onto electrode surface through the formation of amide bonds between amino groups of dendrimer and carboxyl groups of poly-p-ABA. Subsequently， Au ions were coordinated in the interior of dendrimer and then reduced to form gold nanoparticles （AuNPs）. The resulting electrode （GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）） provided numerous amino groups to allow highly dense immobilization of E. coli， and facilitated the improvement of electrochemical responses. The rabbit anti-E. coli polyclonal antibody （Ab1） was captured by the electrode surface-confined E. coli， followed by the attachment of the enhanced gold nanoparticle labels （Ab2-Au-Th） featuring thionine （Th） as signal-generating molecule. The analysis of E. coli was performed by electrochemical detection of Th in the bound labels on the electrode surface. Under the optimal experimental conditions， a linear relationship between the peak current of Th and the logarithmic value of E. coli concentration ranging from 1.0×102 cfu/mL to 1.0×106 cfu/mL was obtained with a detection limit of 70 cfu/mL （S/N=3）. The proposed strategy was also used to determine E. coli in samples obtained from waste water treatment plant， and the recoveries of standard additions were in the range of 89.4% to 105.8%. The results confirmed that the electrochemical immunoassay gave a useful protocol for E. coli analysis with high sensitivity， specificity and acceptable accuracy， and thus could potentially become a promising technique for estimating the feasibility of sludge recycling.

Keywords Urban sludge； E. coli； Dendrimer； Functionalized gold nanoparticle labels； Electrochemical immunosensing