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PCR方法检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进

2016-01-27樊琛徐旺烨李丹丹等

江苏农业科学 2015年11期
关键词:套式大肠杆菌检出率

樊琛 徐旺烨 李丹丹等

摘要:采用KOD酶和rTaq酶,分别通过套式PCR检测10株大肠杆菌iss基因,以探讨PCR检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进方法。结果表明,rTaq酶、KOD酶对大肠杆菌iss基因1次PCR检出率分别为40%、70%,套式PCR检出率分别为80%、100%;KOD酶1次PCR检出率高于rTaq酶,但未达100%,采用KOD酶套式PCR可降低大肠杆菌iss基因的漏检可能性。

关键词:PCR检测;iss基因;套式;检出率;大肠杆菌

中图分类号: S852.61+2文献标志码: A文章编号:1002-1302(2015)11-0069-02

收稿日期:2014-11-07

基金项目:国家自然科学青年基金(编号:31302128)。

作者简介:樊琛(1978—),女,山东聊城人,博士,副教授,主要从事病原体分子生物学、食品安全研究。E-mail:fanchen7810@126.com。iss基因(increased serum survival gene)是编码大肠杆菌补体抗性的基因,大小为309 bp,在人源、禽源大肠杆菌中皆有发现。1979年,Binns等从人源大肠杆菌ColV、I-K94质粒获得iss基因表达,能显著增强含此基因大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力,还能增强转化菌的血清抗性[1-2]。目前,国外相关研究者大多将iss基因检测作为大肠杆菌毒力检测的参考指标之一,以1次PCR检测结果iss+或iss-来判定iss基因在大肠杆菌中的存在情况。大肠杆菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探针方法检测,这2种方法检测结果可能出现不符合性,即某菌株PCR检测可能为iss+而探针检测为iss-,或PCR检测为iss-而探针检测为iss+[3-5]。而在实际应用中,多以PCR检测结果判定iss在大肠杆菌中的存在情况。本试验探讨PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷的原因和改进方法,以提高PCR检测大肠杆菌iss基因的准确性。1材料与方法

1.1菌株及其来源

10株大肠杆菌,分别采自黑龙江省、山东省、贵州省、新疆维吾尔自治区、北京市等地的鸡场。

1.2引物合成

1.3酶类及主要生化试剂

蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA连接酶、pMD19-T vector克隆载体及相关试剂,均购自宝泰克生物工程公司;DNA胶回收试剂盒,购自上海华舜生物工程有限公司;所用试验试剂均为分析纯。

1.4大肠杆菌DNA提取

将待测菌琼脂板划线分离,挑取平板上菌落直径2 mm的单菌落;加入40 μL裂解液(10 mmol/L Tris-Cl、pH值为7.5,1 mmol/L EDTA)和50μg/mL蛋白酶K,混匀;55 ℃温育10 min,再于80 ℃温育10 min,加80 μL灭菌三蒸水,-20 ℃保存。

1.5iss基因检测扩增反应体系

iss PCR扩增反应体系为:10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板5 μL、灭菌三蒸水33.5 μL,rTaq酶0.5 μL,共50 μL。套式PCR扩增反应体系为:10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板 2 μL、灭菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL,共50 μL。

1.6扩增反应程序

1.6.1rTaq酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min;97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s,9个循环;95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s,25个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。重复2次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应,反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,28个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。经连接转化,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6.2KOD酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min;97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s,9个循环;95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s,25个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。重复1次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应,反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s,28个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。同时做空白对照。经连接转化,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2结果与分析

由表1可见,10株大肠杆菌都含有iss基因;rTaq酶1次PCR检测4株菌株为阳性,6株为阴性,检测率为40%;套式PCR检测出现特异条带,2株菌株检测为阴性,扩增出的iss基因经序列测定,其核苷酸序列符合已发表的iss基因核苷酸序列,rTaq酶套式PCR检出率为80%;KOD酶1次PCR检测7株菌株为阳性,3株为阴性,检出率为70%,但重复性上有差异,阴性、阳性菌株有所不同,套式PCR检测也出现特异条带,10株大肠杆菌都含有iss基因,检出率为100%,扩增出的iss基因经序列测定,其核苷酸序列与已发表的iss基因核苷酸序列也相符。

3结论与讨论

研究发现,iss基因在致病性大肠杆菌中的存在率要高于非致病性大肠杆菌。Johnson等对20株禽大肠杆菌进行iss基因扩增及致病性试验,结果表明,6株致病性菌株为iss基因扩增阳性,14株非致病性菌株中有11株未扩增出iss基因、3株扩增出iss基因[7]。关于iss基因的定位,近来普遍认为iss基因是定位在ColV质粒上。有研究表明,在产生大肠菌素V(colicin V)的菌株中,人血液中有95.5%的菌株携带iss基因,肠道中有68.8%的菌株携带iss基因;禽源大肠杆菌iss基因与ColV同时出现的概率很高,iss基因很可能与ColV质粒连在一起[8-9]。大肠杆菌ColV质粒是低拷贝的大质粒[10-11]。本试验PCR所用模板为菌体经蛋白酶K消化后的粗提物,菌体消化程度可能影响PCR扩增效率,采用常规质粒提取及大质粒提取方法均未获得ColV质粒。另外,由于ColV质粒在各菌株中的拷贝数可能有所差异,也会导致ColV质粒极低拷贝的菌株在1次PCR时未能扩增出目的条带。

试验结果表明,rTaq酶与KOD酶1次PCR时,iss基因的检出率分别为40%、70%,套式PCR检出率分别为80%、100%,KOD酶检测大肠杆菌iss基因的检出率均高于rTaq酶,KOD酶对大肠杆菌iss基因扩增效率优于rTaq酶。在重复性方面,KOD酶1次PCR检测10株菌株中有2株菌株出现差异,可能与模板制备中菌体消化裂解程度及操作误差有关;KOD酶套式PCR结果无差异,采用KOD酶套式PCR检测能降低大肠杆菌iss基因的漏检率。

参考文献:

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:71-73.

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