陈春暖，陈祥荣，蔡乾昆，叶励超，蔡若蔚，万琼红，王涛

（福建医科大学附属第二医院1神经内科，2神经外科，泉州362000；3华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉430020）

帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一种中老年人群常见的慢性神经退行性疾病，其主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元选择性变性缺失和路易小体形成。目前其病因和发表机制尚未完全阐明。多数学者认为PD是由遗传易感性、年龄老化及环境因素等多因素共同作用的结果。近年来研究认为蛋白质降解障碍是导致PD发生的重要机制之一。

3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一种在能量代谢中起重要作用的经典糖酵解酶蛋白。GAPDH最初被认为是一个参与糖酵解过程的简单管家基因和内参蛋白，近年来的研究发现GAPDH并非一个功能单一的蛋白质，除糖酵解作用外，还参与多种细胞生理过程，如膜融合和转运、DNA修复、核RNA输出、细胞骨架动态平衡、钙稳态调节、细胞凋亡及肿瘤发生等[1,2]。GAPDH 与神经变性疾病相关蛋白，如α-突触核蛋白（α-synuclein）、β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）和亨廷顿蛋白（huntingtin）等有相互作用，参与多种因素诱导的神经细胞凋亡。越来越多证据表明GAPDH与PD等神经变性疾病具有密切关系[1,2]。

细胞内泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway，ALP）是蛋白降解的两个主要途径，负责细胞内大多数蛋白质的降解。UPS参与细胞增殖分化、DNA损伤修复、细胞黏附及细胞凋亡等生命过程[3]。ALP作为细胞内另一种重要的蛋白降解途径，负责UPS未能降解的错误折叠蛋白等大分子物质的降解，参与细胞生长、分化及细胞重塑等生理过程[4]。两者共同在细胞新陈代谢中发挥非常重要的作用。蛋白降解途径功能受损可导致蛋白清除障碍使得蛋白在细胞内积聚，这两条途径功能障碍都可能导致神经变性和细胞死亡，与PD的发生存在密切关系[5]。

鱼藤酮（rotenone）是一种常用的鱼塘清理剂和杀虫剂，是广泛存在于自然界的环境毒素，与我们的生活密切相关且容易接触。它通过抑制线粒体复合物Ⅰ活性，抑制线粒体呼吸链对氧的利用，使细胞缺氧而发挥毒性作用。作为一种新型的造模工具药，目前广受关注。线粒体功能障碍也是PD发病的重要机制之一，我们选取鱼藤酮诱导多巴胺能神经细胞SH-SY5Y建立PD细胞模型，能够很好地模拟PD的发病机制[6]。本研究在模型中观察细胞内GAPDH表达变化，并分别加入蛋白酶体和自噬抑制剂及激活剂处理细胞，研究两种蛋白降解途径对细胞内GAPDH降解的作用。

材料和方法

1 材料

SH-SY5Y细胞购自武汉大学典型培养物储藏中心；DMEM/F12培养基购自Gibco公司；鱼藤酮、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）及自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin）为美国Sigma公司产品；鼠抗GAPDH购自Millipore公司；鼠抗β-actin购自武汉三鹰公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗购自美国Pierce公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒等购自碧云天公司；SDS-PAGE制胶试剂盒购自谷歌生物公司。鱼藤酮、MG132和rapamycin用DMSO作为溶剂配制储存液，MG132和rapamycin储存液浓度分别为20mg/ml和100μmol/L。3-MA溶于水，储存液浓度为100mmol/L。蛋白酶体激活剂氯化镁（MgCl2）储存液用PBS配制，储存液浓度为0.5g/ml。

2 细胞培养、药物处理及分组

SH-SY5Y细胞用DMEM/F12培养基〔其内含10%（体积分数）灭活胎牛血清，青霉素、链霉素终浓度均为100U/L〕培养。使用1μmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24h建立PD细胞模型[6]。实验分为6组,包括正常对照组（Con）、鱼藤酮处理组（Rot）、鱼藤酮+蛋白酶体抑制剂组（Rot+MG132）、鱼藤酮+蛋白酶体激活剂组（Rot+MgCl2）、鱼藤酮+自噬抑制剂组（Rot+3-MA）和鱼藤酮+自噬激活剂组（Rot+Rap），处理时间为24h。

3 MTT法检测细胞活力及选取药物浓度

调节SH-SY5Y细胞密度，以每孔103～104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μl。细胞贴壁后，加入不同终浓度的MG132、3-MA、rapamycin和MgCl2，并设空白组、溶剂对照组及正常对照组，孵育24h，每组设五个平行孔。观察形态之后，每孔加入 MTT 溶液（5mg/ml）20μl，继续培养 4～6h，弃除培养基，每孔加入DMSO 150μl，振荡10min，使甲臜充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定每孔在490nm波长处的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率=药物组OD值/空白对照组OD值×100%。根据统计分析实验结果选取以下有效药物浓度：MG132 5mmol/L、MgCl250mmol/L、Rapamycin 0.2μmol/L、3-MA 10mmol/L。再根据本实验分组Con组、Rot组、Rot+MG132组、Rot+MgCl2组、Rot+3-MA组和Rot+Rap组，待细胞贴壁生长后，更换为含有终浓度为1μmol/鱼藤酮及上述终浓度相应药物的培养基培养24h，每组设5个复孔，观察细胞形态，行MTT检测。

4 Western blot检测细胞GAPDH蛋白表达

细胞于5 mL培养瓶中传代培养，待细胞长满70%～80%后，根据实验分组更换为相应药物的培养基继续培养24h后，观察细胞形态后，用RIPA裂解液分别提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳；蛋白转移至PVDF膜，5%（50 g/L）脱脂奶粉封闭2h。封膜，加入鼠抗GAPDH抗体（1∶1000）或鼠抗β-actin抗体（1∶2000）4℃过夜。清洗后加入HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶5000）室温孵育2h，洗膜后用ECL曝光、显影。根据蛋白相对分子质量（GAPDH：37000；β-actin：43000）确定目的条带位置，用图像分析软件分析条带光密度。以β-actin为内参蛋白，将两者光密度比值（GAPDH/β-actin）作为GAPDH蛋白的相对表达量，以空白对照组相对表达量为1，观察各组GAPDH的表达情况。上述实验均至少重复3次。

5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准差（±s）表示。各实验组间细胞存活率及GAPDH相对表达量的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 激活蛋白酶体和自噬通路减轻鱼藤酮细胞毒性

显微镜观察显示，无药物处理的正常对照组SHSY5Y细胞24h时生长较密，突起明显且细长，轻摇晃培养基细胞不易脱落，细胞贴壁能力强。各药物处理组细胞在24h时生长部分抑制：鱼藤酮1μmol/L组细胞突起变短和减少，胞体稍肿胀，细胞部分圆缩；鱼藤酮加5mmol/L MG132和鱼藤酮加10mmol/L 3-MA处理的细胞生长受抑制更明显，其中Rot+3-MA组漂浮、圆缩细胞更多；Rot+Rap（0.2μmol/L）和Rot+MgCl2（50mmol/L）细胞突起明显细长，肿胀及圆缩细胞较单独鱼藤酮组少（图1）。

图1 蛋白酶体和自噬通路活性对鱼藤酮细胞形态毒性的影响。比例尺，100μmFig. 1 Effects of proteasome and autophagy pathway activities on the morphology of rotenone induced SH-SY5Y cells. Scale bar, 100μm

MTT法检测显示，鱼藤酮、鱼藤酮+MG132、鱼藤酮+3-MA、鱼藤酮+rapamycin和鱼藤酮+MgCl2处理的SH-SY5Y细胞活性明显下降，其中以Rot+3-MA组抑制细胞活性更明显（图2A）。虽然各药物对鱼藤酮处理细胞的活性无明显影响（图2A），但各药物单独处理SH-SY5Y细胞24h发现，鱼藤酮、MG132和3-MA均明显抑制细胞活性，而rapamycin和MgCl2对细胞活性几乎没有影响（图2B）。

2 激活蛋白酶体和自噬通路抑制鱼藤酮对GAPDH水平的上调

Western blot检测表明，鱼藤酮处理后细胞内GAPDH蛋白水平上调，加入蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体途径抑制剂3-MA后细胞内GAPDH上升更明显，加入蛋白酶体促进剂MgCl2和溶酶体途径激活剂rapamycin均可抑制鱼藤酮诱导的GAPDH水平上调，以MgCl2的抑制作用更为明显，而rapamycin的抑制作用与单独鱼藤酮处理组、正常对照组比较无显著差异（图3）。

图2 蛋白酶体和自噬通路活性对SH-SY5Y细胞活性的影响。*与正常对照组比较，0.01＜P＜0.05；#与鱼藤酮组比较，0.01＜P＜0.05Fig. 2 Effects of proteasome and autophagy pathway activities on the viability of SH-SY5Y cells. *, 0.01＜P＜0.05, compared with normal control group;#, 0.01＜P＜0.05, compared with rotenone group

图3 鱼藤酮及蛋白酶体和自噬活性对SH-SY5Y细胞GAPDH水平影响的Western blot检测。A，代表性Western blot；B，鱼藤酮及蛋白酶体和自噬活性对SH-SY5Y细胞GAPDH水平影响的统计学分析；*与正常对照组比较，0.01＜ P ＜0.05；#与单独鱼藤酮处理组比较，0.01＜P＜0.05Fig. 3 Western blot analysis on the effects of rotenone as well as proteasome and autophagy pathway activities on the levels of GAPDH in SHSY5Y cells. A, representative Western blot; B, statistical analysis on the effects of rotenone and proteasome and autophagy pathway activities on GAPDH levels; *, 0.01＜P＜0.05 vs normal control; #, 0.01＜P＜0.05 vs rotenone treatment

讨 论

在PD中发现存在着UPS和ALP这两条降解通路功能的异常[7-9]。多种因素如环境毒素暴露、基因突变等，均可诱发细胞内蛋白过表达和异常聚集，当细胞内这些蛋白超过了自身清除能力或由于蛋白清除系统功能障碍，都必将加重功能异常蛋白质聚集，导致包涵体形成，对神经元造成损伤并最终导致神经元死亡。蛋白异常聚集不仅是包涵体形成的重要分子基础，并可能与氧化应激、线粒体功能障碍等密切相关，也是PD发病的重要分子机制。本课题组采用鱼藤酮建立PD细胞模型，在模型中也发现蛋白的过表达及异常聚集，能够很好地模拟PD的发病机制，具有可靠性[6,10]。

本研究中，我们选择目前较为公认的蛋白酶体抑制剂MG132和促进剂Mg2+、自噬抑制剂3-MA和激活剂rapamycin[5,11]，其中Mg2+是参与UPS泛素化修饰的重要分子，可增加E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的酶活性，从而促进蛋白降解。从细胞形态来看，正常对照组SH-SY5Y细胞生长较密，神经突起明显且细长，细胞贴壁能力强。各药物处理组细胞生长均不同程度受抑制，单独鱼藤酮组细胞突起变短、减少，胞体稍肿胀，细胞部分圆缩；加入蛋白酶体和自噬途径抑制剂后细胞生长受抑制更明显，其中自噬途径抑制剂组漂浮、圆缩细胞更多；而加入蛋白酶体和自噬途径激活剂后细胞突起细长，肿胀及圆缩细胞较单独鱼藤酮组少；MTT结果也显示药物处理组细胞活性受抑制，其中自噬途径抑制剂组抑制细胞活性最明显。本课题组前期实验结果发现鱼藤酮诱导的细胞模型中存在GAPDH的过表达[10,12]。本实验主要探讨鱼藤酮诱导后GAPDH在细胞内的降解途径。在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中，加入蛋白酶体和自噬溶酶体途径抑制剂和激活剂，观察UPS和ALP这两个降解通路与GAPDH降解的关系。结果显示，鱼藤酮诱导GAPDH过表达，加入蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂3-MA后细胞内GAPDH上升更明显，说明两种降解途径抑制剂均抑制了GAPDH的降解，而蛋白酶体途径抑制剂作用更明显；加入蛋白酶体促进剂Mg2+和自噬激活剂rapamycin后鱼藤酮对细胞GAPDH水平的上调作用被明显抑制，且以Mg2+的作用更明显，说明两种途径的激活剂均可促进GAPDH的降解，而以蛋白酶体途径更明显。本实验说明，UPS和ALP两种途径都参与GAPDH的降解，加入UPS途径抑制剂和激活剂GAPDH的变化较ALP途径稍明显，推测UPS可能在GAPDH降解中发挥更重要的作用。

UPS和ALP功能异常可导致蛋白质清除障碍和异常聚集[13,14]。PD遗传学研究显示parkin（一种E3泛素连接酶）和UCH-L1基因突变可导致家族性PD发生，这两种基因编码蛋白都参与泛素依赖的细胞内蛋白质降解[5,15]。在路易小体中发现蛋白酶体亚单位，也进一步说明UPS损害与PD的发生和进展有关[16]。帕金森病相关蛋白PINK1参与聚集体形成过程中既有泛素化因素也有自噬因素，也说明两条途径在PD发病机制中的重要作用[17]。α-突触核蛋白（α-synuclein）是路易小体的重要组分，与PD发病机制密切相关。使用蛋白酶体抑制剂诱导UPS损害可以导致α-突触核蛋白聚集，促进包涵体形成和增加细胞死亡[15,18]。另外，自噬也是细胞内大分子蛋白和受损细胞器的主要降解方式，通过形成双层膜结构的自噬体，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，通过溶酶体酶降解其内容物[19]。研究显示聚集倾向的蛋白也可通过自噬途径降解[20]。α-突触核蛋白就是一个例子，它不仅通过UPS降解，也通过ALP降解[21]，通过调控UPS和ALP进而促进易聚集蛋白的清除可能成为延缓PD疾病进展的一个潜在的治疗靶点。结合国内外研究现状及我们的研究结果，GAPDH也是一个聚集倾向的蛋白，它与α-突触核蛋白的关系密切，共同参与路易小体形成[1]。本实验结果提示GAPDH与α-突触核蛋白一样，可能都通过UPS和ALP两条途径降解，也进一步证实这两条蛋白降解途径在PD发病机制中的重要作用。