任媛，苏新明，陆常玲，李朋，李孟露，康健

(中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所，沈阳，110001)

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道异质性疾病，在其整个疾病进程中大量基因被异常激活，基因表达水平显著高于正常人群[1]。组蛋白的共价修饰与基因表达调控密切相关，其中由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetylases, HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）调控的乙酰化修饰在基因转录激活过程中至关重要[2]。哮喘致病时患者体内HDACs活性降低，HATs活性升高，且HDACs抑制剂干预能够有效缓解哮喘相关气道炎症、气道重塑和气道高反应[3-7]。但HDACs家族成员众多，迄今为止哮喘致病时各成员在肺组织中的表达形态改变仍不清楚。我们的团队在应用不同亚型HDACs抑制剂（广谱HDACs抑制剂、HDAC6特异性抑制剂、HDAC8特异性抑制剂）干预哮喘小鼠时发现：尽管不同亚型的HDACs抑制剂均能够有效缓解哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应，但HDAC8特异性抑制剂的抗炎效果要优于其他HDACs抑制剂[8]。同时，许多学者认为HDAC8在T细胞增殖分化凋亡以及平滑肌细胞分化、收缩等病理生理中均发挥了重要作用[9-11]。因此，本次研究的目的主要是明确哮喘致病时HDAC8在肺组织中的表达定位和表达水平，探讨HDAC8与哮喘发病的关系。

材料和方法

1 小鼠哮喘模型制备及分组

6～8周SPF级雌性BALB/C小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司[动物许可证号：SCXK(辽)2010-0001]。随机数字表法分为正常组和哮喘组，12只/组。于实验第0、7、14d，哮喘组小鼠予以卵蛋白OVA（20μg）和氢氧化铝凝胶（2mg）混悬液腹腔注射致敏。末次致敏1周后，应用超声雾化装置（3ml/min）进行OVA（20mg/ml）雾化激发8周，3次/周，30min/次。正常组均以等量生理盐水代替OVA处理。

2 HE染色评估哮喘建模

末次激发实验24h后，各组小鼠麻醉处死，取左侧肺组织，固定，包埋，切片（5μm）后行HE染色。石蜡切片脱蜡水化，苏木素染5～10min，自来水冲洗5min，盐酸酒精分化3s，自来水洗返蓝30min，伊红复染1～2min，自来水洗去浮色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察哮喘组小鼠气道肺组织炎症浸润水平。

3 免疫组织化学染色观察HDAC8在肺组织中的表达分布

行肺组织HDAC8免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡水化，3% H2O2室温孵育5min，PBS 洗3次，5min/次；微波炉抗原修复24min，6min/次，PBS 洗3次，5min/次；10% BSA室温孵育30min，HDAC8多克隆抗体（1∶500，美国，Novus）4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1：500；北京中杉金桥生物技术有限公司37 ℃ 孵育60min，PBS 洗3次，5min/次；DAB法显色5～10min，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。光镜下观察HDAC8在各组小鼠肺组织中的表达分布。

4 Western Blot检测肺组织中HDAC8水平

取右侧新鲜肺组织30～50mg加入RIPA裂解液(含10%PMSF)，冰上剪碎匀浆，超声粉碎，4℃12000g离心，30min后取上清。BCA法测蛋白浓度，调整浓度并变性后，采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳（80V，30min；120V，90min）分离。将蛋白转染到PVDF膜上（0.25mA，60min），脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h。HDAC8多克隆抗体（1∶1000，美国，Novus）4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育1h，ECL法检测蛋白表达，凝胶成像系统成像（美国UVP公司），Gel-Pro analyzer凝胶定量分析软件进行结果分析。

5 HDAC8酶活性荧光定量分析

取右侧新鲜肺组织，采用细胞核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，BCA法测定蛋白浓度，荧光法[12]检测肺组织中HDAC8酶活性，操作方法按试剂盒（HDAC8 Activity Fluorometric Assay Kit，美国，BioVision）内附说明书操作，其基本步骤如下： HA1溶用液蒸馏水稀释10倍， 核蛋白用HA2溶液稀释至1μg/μl，按照样品孔、空白孔、标准品孔加样，37℃ 孵育 60～90min，每孔再加入 150μl HA3 溶液，37℃孵育30～45min，150μl HA1溶液洗板3次，用HA1溶液将HA4稀释200倍后，取50μl加入至各反应孔中，摇床上室温孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，用HA1溶液将HA5稀释1000倍后，取50μl加入至各反应孔中，室温孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，每孔加入100μl HA6溶液，避光室温孵育10min，每孔加入50μl HA7溶液，立即测定OD450nm，计算HDAC8酶活性。

6 统计学分析

结 果

1 哮喘小鼠肺组织炎症浸润水平

HE染色观察显示，正常小鼠肺组织中气道上皮细胞排列整齐，基底膜连续完整，肺组织炎症细胞浸润几不可见；与正常小鼠相比，哮喘小鼠肺组织气道上皮细胞脱落，基底膜暴露，气道及血管周围可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润（图1），表明哮喘建模成功。

图1肺组织HE染色。A，正常小鼠肺组织；A’，A中方框内放大图像；B，哮喘组小鼠肺组织；B’，B中方框内放大；箭头，炎症细胞；比例尺，50μmFig. 1 HE stain of lung tissue. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’,enlarged image of the square frame in B; arrows indicate inflammatory cells; scale bar, 50μm

2 HDAC8在肺组织中的免疫组织化学表达

2.1 哮喘小鼠气道上皮细胞高表达HDAC8

正常小鼠气道上皮细胞质中可见少量的HDAC8表达。与正常小鼠相比，哮喘小鼠气道上皮细胞中HDAC8棕黄色染色明显，免疫反应性明显增强（图2）。

图2 HDAC8在各组小鼠气道上皮细胞中的免疫组织化学表达。A，正常小鼠肺组织；A’，A中方框内放大图像；B，哮喘组小鼠肺组织；B’，B中方框内放大；箭头，HDAC8阳性染色细胞；比例尺，50μmFig. 2 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the airway epithelial cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression;scale bar, 50μm

2.2 哮喘小鼠气道血管周围炎症细胞高表达HDAC8

免疫组织化学染色显示，正常小鼠肺组织气道血管结构清晰，周围并未发现炎症细胞浸润；与正常小鼠相比，哮喘小鼠气道血管周围可见大量炎症细胞浸润，且浸润的炎症细胞中可见HDAC8显著表达，但HDAC8在炎症细胞中表达水平并不均匀（图3）。

图3 HDAC8在各组小鼠气道血管周围炎症细胞中的免疫组织化学表达。A，正常小鼠肺组织；A’，A中方框内放大图像；B，哮喘组小鼠肺组织；B’，B中方框内放大；箭头，HDAC8阳性染色细胞；比例尺，50μmFig. 3 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the inflammatory cells around the vascular and airway. A, lung tissue of the normal mouse; A’,enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

2.3 哮喘小鼠血管平滑肌细胞高表达HDAC8

正常小鼠肺动脉和微血管平滑肌中未见HDAC8表达；OVA雾化8周后，可见哮喘小鼠肺动脉平滑肌细胞以及微血管平滑肌中HDAC8表达呈强阳性，尤其在肺微血管平滑肌中可见HDAC8表达水平明显升高（图4）。

2.4 哮喘小鼠肺泡腔炎症细胞高表达HDAC8

正常小鼠肺泡腔中仅见少量炎症细胞，且炎症细胞中HDAC8表达极少。与正常小鼠相比，哮喘小鼠肺泡腔中可见大量以巨噬细胞和嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞，且在这些炎症细胞中HDAC8表达水平显著增多（图5）。

3 哮喘小鼠肺组织HDAC8水平升高

Western blot进一步检测HDAC8在肺组织中的总体水平，发现与正常小鼠相比，哮喘小鼠肺组织中HDAC8的总体水平显著升高（图6A、B）。

4 哮喘小鼠肺组织中HDAC8活性增强

荧光定量分析检测HDAC8活性发现，在正常肺组织HDACs活性较低，哮喘小鼠肺组织中HDAC8活性较正常小鼠显著升高（图6C）。

讨 论

目前哺乳类HDACs已知有4类18种，不同类别的HDACs通过调节不同底物的乙酰化修饰参与体内多种应激性反应[13]。其中HDAC8是I类HDACs家族的重要成员，在全身多脏器中均有表达，与体内T细胞增殖分化、炎性免疫应答、以及平滑肌细胞分化收缩等过程均密切相关[14-16]。本次研究结果显示，HDAC8在健康小鼠肺组织中表达极少，而在以嗜酸性炎症为主的慢性哮喘小鼠肺组织中表达水平和酶活性均显著上调。免疫组织化学染色发现HDAC8高表达于气道上皮细胞、气道血管周围以及肺泡腔炎症细胞和血管平滑肌细胞，尤其在新生血管的平滑肌细胞中可见HDAC8规律且特异性表达。然而有意思的是在支气管气道平滑肌细胞中HDAC8表达却并不明显。本团队既往的研究发现，哮喘致病过程中血管平滑肌细胞的表型、结构和功能均发生病理性改变，且直接参与哮喘时血管的损伤修复以及再生和重塑过程[17-19]。综合HDAC8在哮喘肺组织血管中的表达特点以及哮喘致病时血管表型和功能的异常改变，我们推测HDAC8很可能参与哮喘致病时血管的再生与重塑。

图4 HDAC8在小鼠血管平滑肌细胞中的免疫组织化学表达。A，正常小鼠肺内动脉；A’，A中方框内放大图像；B，正常小鼠肺内微血管；B’，B中方框内放大图像；C，哮喘组小鼠肺内动脉；C’，C中方框内放大；D，哮喘组小鼠肺内微血管；D’，D中方框内放大；箭头，HDAC8阳性染色细胞；比例尺，50μmFig. 4 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the vascular smooth muscle cells. A, pulmonary artery of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, pulmonary capillaries of the normal mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; C, pulmonary artery of the asthma mouse; C’, enlarged image of the square frame in C; D, pulmonary capillaries of the asthma mouse; D’, enlarged image of the square frame in D; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

尽管哮喘和COPD都属于呼吸系统气道炎症性疾病，但研究发现在COPD患者体内HDAC8表达水平显著低于健康人，而我们的研究结果却提示哮喘小鼠体内HDAC8表达水平显著升高。HDAC8这一截然相反的变化趋势很可能是由于哮喘和COPD两者在炎症细胞表型和分子特征上皆不同所致[20]，即COPD则主要是由中性粒细胞介导的炎症反应，而我们的哮喘模型主要表现为嗜酸性粒细胞性炎症，而哮喘中HDAC8的升高很可能与哮喘中嗜酸粒细胞炎症反应相关。从免疫组织化学染色结果也可看出，在哮喘肺组织气道血管周围以及肺泡腔炎症细胞中HDAC8表达并不均匀，嗜酸性粒细胞和巨噬细胞中HDAC8的表达水平明显高于其他炎症细胞。

目前针对HDAC8的选择性抑制剂的研究越来越受到人们的重视，其中PCI-34051是一个低分子量的异羟肟酸类化合物，是HDAC8的特异性抑制剂，应用PCI-34051干预哮喘小鼠能够显著缓解哮喘气道炎症、气道重塑和气道高反应[21]。尽管PCI-34051作用于哮喘的具体机制尚不明确，但有研究显示HDAC8能够调控组蛋白上H3K9、H2BK12、H3K18的乙酰化水平，影响下游基因转录激活[22]，这一结果很有可能为HDAC8作用于哮喘的具体机制研究带来新突破。

图5 HDAC8在各组小鼠肺泡腔炎症细胞的免疫组织化学表达。A，正常小鼠肺组织；A’，A中方框内放大图像；B，哮喘组小鼠肺组织；B’，B中方框内放大；箭头，HDAC8阳性染色细胞；比例尺，50μmFig. 5 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the alveolar inflammatory cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

图6 HDAC8在各组小鼠肺组织中的表达水平和活性检测。 A，HDAC8水平的Western blot检测代表性结果；B，HDAC8水平的统计学分析；C，HDAC8活性荧光检测结果的统计学分析；*，与正常组比较，P＜0.01Fig. 6 Detection for expression level and activity of HDAC8 in the lung tissue. A, representative results of HDAC8 level detected by Western blot; B,statistical analysis for expression level of HDAC8 detected by Western blot; C, statistical analysis for activity of HDAC8 detected by fluorometric assay;*, P＜0.01, compared with the normal group