窦姗姗 高丽颖 林馨怡 孟 尧 董 康 程葆华

(济宁医学院基础医学院，济宁 272067)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的神经退行性疾病[1]，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元发生退行性变，并伴有路易氏小体(Lewy body，LB)出现。LB主要是由于α-突触核蛋白(α-synuclein)的异常积累形成的[2]。PD的发病机制还不清楚，而线粒体功能障碍与PD发病机制密切相关[3-4]。

鱼藤酮(rotenone)是一种细胞毒性物质，可选择性地抑制细胞呼吸链 NADH 脱氢酶(即复合物I，complex I)的活性，使NADH氧化为NAD的过程受阻，减少ATP生成，阻碍质子传递，细胞中活性氧的含量进而增加，导致自由基过量累积，从而促进细胞凋亡[5-6]。

Apelin最初是从牛胃组织中分离出来的。Apelin-13、apelin-17和apelin-36是apelin前体肽经水解生成的生物活性形式。越来越多的证据表明，apelin可能在PD模型中具有神经保护作用[7-8]。

本实验用鱼藤酮刺激SH-SY5Y细胞，制作PD体外模型，然后用apelin-36干预，研究apelin-36的神经保护作用及对线粒体功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂 人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞)购自美国菌种保藏中心(ATCC)；DMEM培养液(美国Hyclone公司)；鱼藤酮(美国Sigma公司)；Apelin-36(美国Phoenix Pharmaceuticals公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；Hoechst 33342检测试剂盒(日本Dojindo公司)；线粒体复合物 I(complex I)ELISA 试剂盒(酶免),ADP/ATP比率检测试剂盒(日本Dojindo公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(天根生物公司)；超敏ECL化学发光试剂盒(万类生物公司)；α-synuclein抗体、bcl-2抗体、Bax抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗体(北京中杉金桥有限公司)。

1.1.2仪器 微量移液器(德国 Eppendorf公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；台式低温高速离心机(美国Beckman公司)；超声波细胞粉碎仪(江苏波场智能科技股份有限公司)；普通光学显微镜、倒置生物显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪、电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；激光共聚焦扫描显微镜(SP8)(德国 Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 SH-SY5Y细胞培养于DMEM培养基中，内含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml)。将SH-SY5Y细胞接种于96、12或6孔板在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞生长至约90%后，后续根据需要加入鱼藤酮和apelin-36。

1.2.2药物处理及分组 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以5×104/孔的密度接种于96、12或6孔板中，随机分成4组：对照组、apelin-36组、鱼藤酮组、apelin-36+鱼藤酮组，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至约90%，apelin-36组、apelin-36+鱼藤酮组先给予apelin-36(10-6M)预处理，其他两组加入相同剂量的PBS，鱼藤酮组、apelin-36+鱼藤酮组2h后给予鱼藤酮(500 μM)处理，其他两组加入相同剂量PBS，放入培养箱培养24h，然后进行后续实验。

1.2.3细胞活力测定 用CCK-8法测定细胞活力。首先将SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在96孔培养板中，细胞长至约90%，按上述方法进行药物处理。继续培养约22h后，加入CCK-8溶液(10μl/孔)，避光继续孵育2h。最后在酶标仪450nm处测量吸光度值。每组设6个复孔，实验平行重复3次。

1.2.4细胞凋亡检测 将SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板的盖玻片上，细胞长至约90%，后按上述方法药物处理。继续培养约22h后，用PBS冲洗细胞，用4%多聚甲醛固定20min，然后用PBS清洗3次。随后，加入5mg/ml的Hoechst 33342，避光在室温下放置15min，再用PBS冲洗两次。染色细胞在倒置荧光显微镜下成像。每组选择3张照片，计数凋亡细胞数。

1.2.5线粒体复合物-I(complex I)检测 SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在6孔培养板中。细胞长至约90%，然后按上述方法进行药物处理。继续培养约22h后，去除上清液，按照人Complex I ELISA试剂盒的说明进行操作。

1.2.6ADP/ATP比率检测 SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在白色96孔培养板中。细胞长至约90%，后按上述方法药物处理。继续培养约22h后，按照ADP/ATP比率检测试剂盒说明操作。

1.2.7相关蛋白表达检测 Western blotting用于检测Bax、bcl-2、α-synuclein的表达，β-actin作为对照。方法如下：按上述方法处理细胞，然后将SH-SY5Y细胞中提取的等量蛋白质(30μg)加载到10% SDS-PAGE上，随后转移到PVDF膜上。在室温下，用含5%无脂奶粉的TBST(含1%吐温20的TBS缓冲液)封闭膜1h，然后在4℃与一抗孵育过夜。然后用TBST清膜3次，在室温下与二抗(1:5000)孵育1h。最后加入ECL溶液，暗室内曝光显影。实验平行重复3次，用ImageJ软件分析目标条带的灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Apelin-36对鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞活力的影响

鱼藤酮(500μM)降低了SH-SY5Y细胞存活率，而apelin-36(10-6M)预处理减轻了鱼藤酮的神经毒性并提高细胞活力。表明apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞存在一定的保护作用。见图1。

注：***P<0.001 vs.对照组；###P<0.001 vs.鱼藤酮组

2.2 Apelin-36对鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

Hoechst 33342染色结果(图2A)显示，与鱼藤酮组相比，apelin-36减轻了鱼藤酮引起的细胞凋亡，并显著降低了细胞凋亡率(图2B)。

注：***P<0.001 vs.对照组；###P<0.001 vs.鱼藤酮组。

2.3 Apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表达的影响

与对照组相比较，鱼藤酮组bcl-2的表达显著降低，Bax的表达显著增加；而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比，apelin-36则明显上调了bcl-2的表达，减少了Bax的表达(图3A)。鱼藤酮组bcl-2/Bax的比值与对照组相比明显降低，而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比，bcl-2/Bax的比值明显升高，说明apelin-36减轻了鱼藤酮造成的细胞凋亡(图3B)。与对照组相比，鱼藤酮组α-synuclein的表达显著增加，而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比，apelin-36明显减少了α-synuclein的表达(图3C、3D)。

注：**P<0.01 vs.对照组；#P<0.05 vs.鱼藤酮组；##P<0.01 vs.鱼藤酮组

2.4 Apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中complex I和ADP/ATP的影响

与对照组相比，鱼藤酮组complex I的表达下调，ADP/ATP比率显著上调；而与鱼藤酮组相比，apelin-36和鱼藤酮共处理组逆转了这种现象。见图4。

注：***P<0.001 vs对照组；###P<0.001 vs鱼藤酮组；##P<0.01 vs 鱼藤酮组

3 讨论

线粒体是有氧呼吸发生的主要场所，除了为细胞提供能量外，线粒体还参与了细胞信息传递、细胞分化、和细胞凋亡等过程，而且拥有调控细胞生长和细胞周期的能力[9]。研究显示错误折叠的α-synulein的过度累积导致了神经退行性变，而线粒体功能障碍参与了错误折叠的α-synulein累积这一过程[10-11]。

鱼藤酮是一种可直接透过细胞膜和血脑屏障的细胞毒性物质。线粒体complex I可被鱼藤酮选择性地阻断，从而使NADH的氧化过程受阻，ATP生成减少，细胞中活性氧族增加，进而自由基增加，进一步导致氧化应激[12]，最终引起细胞凋亡。因此鱼藤酮可导致细胞线粒体功能障碍，引起细胞凋亡。在本实验中，与对照组相比，鱼藤酮组α-synulein表达明显升高，bcl-2/Bax比值明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡显著增多。Bcl-2家族蛋白是典型的凋亡相关蛋白，可操控线粒体的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax 可与抗凋亡蛋白bcl-2结合形成调节细胞凋亡的异二聚体，当细胞发生凋亡时，bcl-2/Bax比率降低[13]。与鱼藤酮组相比，apelin-36和鱼藤酮共处理组中α-synulein的表达明显降低，说明apelin-36预处理可减少错误折叠的α-synulein累积；同时，apelin-36和鱼藤酮共处理组中bcl-2/Bax比率明显升高，细胞活力显著升高，细胞凋亡则明显减少，说明apelin-36预处理可减少细胞凋亡，因此apelin-36可减轻鱼藤酮对SH-SY5Y细胞的神经毒性作用，对神经细胞起到保护作用。

鱼藤酮通过阻断complex I造成了ATP生成减少，而ATP的生成减少降低了线粒体膜电位(ΔΨm)，导致线粒体膜的通透性改变，引起了线粒体功能紊乱[14-15]。本研究首次在鱼藤酮PD体外模型中通过检测线粒体complex I的表达和ADP/ATP的比率，来讨论apelin-36是否可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱。与对照组相比，鱼藤酮组complex I的表达明显降低，而ADP/ATP的比率显著升高，这说明鱼藤酮造成了线粒体功能紊乱。与鱼藤酮组相比，apelin-36和鱼藤酮共处理组complex I的表达明显升高，而ADP/ATP的比率显著降低，说明apelin-36可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱。

综上所述，apelin-36可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱，减少错误折叠的α-synulein累积，提高细胞活力，减少细胞凋亡，起到神经保护作用。而apelin-36通过何种信号传导途径减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱还不清楚，值得进一步研究，为apelin成为治疗PD的潜在临床药物提供新的证据。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。