万正英，李双兰，马锐

（南阳市张仲景医院内科，南阳 47300000）

血管重构是许多心血管系统疾病如高血压、冠心病、动脉粥样硬化等的重要病理学特征[1]。血管平滑肌细胞是血管壁的主要组成部分，位于管壁的中层；其生物学功能的改变，特别是细胞的过度增生及肥大被认为是引发血管重构的重要原因之一[2-4]；故而深入研究血管平滑肌细胞的生物学行为及其调节机制可为深入认识及防治血管重构提供新的方向和干预靶点。

microRNAs (miRNAs)是一类内源性非蛋白编码的RNA分子，可通过促进mRNA的转录或者在转录后水平抑制其翻译来调控一个或多个靶基因的表达，进而影响细胞的各种生物学功能[5]。近年的大量研究证明，miRNAs可参与调控心血管系统的发育及血管平滑肌细胞的生物学特性[5,6]。许多参与血管重构的miRNAs，如miR-130a可参与调控肺毛细血管内皮细胞的EMT进程，进而参与肺血管重构[7]；miR-4632可靶向c-JUN调控肺主动脉平滑肌细胞的增殖及凋亡[8]。miR-425是近年来最为广泛研究的miRNAs分子之一，定位于3号染色体，具有高度的保守性。但对其研究多集中于肿瘤相关疾病，且在不同类型的肿瘤中miR-425的作用不尽相同。在肝细胞癌中，miR-425可通过多条信号通路发挥原癌基因样作用，促进肿瘤细胞的侵袭转移[9]；而在ER-α阴性的乳腺癌细胞中，miR-425 可靶向CCND2、PTEN等抑制肿瘤细胞的增殖[10]。 miR-425也可表达于心血管系统，研究显示心衰模型大鼠经过一段时间的有氧运动训练之后，可检测到心肌组织中miR-425的高表达[11]。考虑到基因调控的复杂性，且各研究所采用的研究对象及实验条件不尽相同，关于miR-425对人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的具体调控作用及潜在分子机制尚不完全清楚。本研究通过转染miR-425 inhibitor下调人主动脉平滑肌细胞中miR-425的表达，探讨miR-425对HASMCs增殖、周期及迁移等生物学行为的影响，并进一步分析其可能涉及的分子机制。

材料和方法

1 材料与试剂

人主动脉平滑肌细胞HASMCs购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS），DMEM/F12培养基及Opti-NEM培养基均购自美国Gibco公司；血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）购自美国Sigma 公司；Lipofectamine 2000和相关转染试剂购自Invitrogen； PTEN、PI3K、p-AKT/AKT、MMP-9及GAPDH抗体购于美国CST公司；CCK-8细胞增殖分析试剂盒购于日本同仁化学研究所；细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司；miR-425 inhibitor及negative control miRNA、SYBR Green I real-time PCR kit由上海吉玛制药技术有限公司提供；其余试剂均为国产分析纯。

2 细胞培养、转染及分组

实验用HASMCs常规培养于含10% FBS的DMEM/F12完全培养基中；培养箱的培养条件设置为37 ℃，5% CO2。每2d换液，3～5d常规使用0.25%的胰酶消化传代。取对数生长期细胞接种于6孔板上，待细胞生长至60%～80%融合，更换为不含FBS的培养基同步化12h，随后进行转染。组别设置：空白对照组（Control）、阴性对照组（negative control miRNA, NC）、miR-425 inhibitor转染组（miR-425 inhibitor，425-i）。将miR-425 inhibitor或者negtive control miRNA溶解于Opti-MEM培养基中室温孵育5min；同时另取Lipofectamine 2000加入Opti-MEM培养基室温孵育5min，将两者轻柔混合后室温继续反应20min。而后将混合物分别加入相应组别的细胞中，置于培养箱中培养6h后更换为完全培养基继续培养48h。提取细胞蛋白测定转染效率并进行后续实验分析。

3 CCK-8法测定细胞活力

取对数生长期的细胞接种于96孔板中（2×103个/孔），经过相应处理后继续培养22h，向每孔加10μL CCK-8试剂，置于培养箱中继续培养2h。而后用酶标仪测定每孔在450nm波长处的吸光度值。每组设置3个复孔取均值，另设单孔只加入培养基作空白对照。

4 流式细胞术检测细胞周期

各组细胞用不含EDTA的胰酶消化、离心收集细胞。PBS漂洗3次后重悬细胞，同时调整密度至1×106个/mL；加入70%无水乙醇置于4℃避光固定过夜。离心洗去乙醇，加碘化丙啶（PI）染液于37℃避光反应30min，用流式细胞仪检测激发波长488nm处的荧光强度。

5 Transwell检测细胞迁移

收集各组细胞并用培养基重悬，然后调整密度至2×105个/mL。将各组细胞分别接种于Transwell小室的上室中，同时在下室内加入常规培养基，置于培养箱中继续培养24h。取出细胞经PBS冲洗（3次）后用棉签擦除上室表面的细胞，而后将小室置于90%无水乙醇中固定，加0.1%的结晶紫染色，PBS漂洗后倒置显微镜下观察拍照，并计数染色细胞的个数(每组细胞计数5个视野取其均值)。

6 Western blot测定蛋白水平

用含蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解提取各组细胞蛋白，而后用BCA试剂盒进行蛋白定量。调整各组蛋白上样总量至70μg，加入4倍体积的上样缓冲液，变性后进行SDS-PAGE电泳。待蓝色的上样缓冲液 泳出后将蛋白电转至PVDF膜，加5%脱脂牛奶室温封闭90min，依据按说明书要求加入一抗4℃孵育过夜，复温后TBST漂洗5min×3次；加相应二抗室温孵育2h；TBST漂洗10min×3次，暗室中加ECL发光液显影，定影并冲洗胶片。所得结果经Image J 行蛋白灰度半定量分析。

7 qRT-PCR测定mRNA表达

Trizol一步法提取细胞总RNA，依据说明书进行操作。所提RNA经纯化、定量后，取2μg总RNA逆转录合成cDNA，采用SYBR Green I real-time PCR的方法检测mRNA的相对表达量，U6作为内参。引物设计如下：miR-425-F∶ 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’,miR-425-R∶ 5’-ACACTCCAGCTGGGAATGACACGATCACTCC -3’； U6-F∶ 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, U6-R∶ 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ 。PCR 循环条件为 95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 34s，45个循环。记录CT值并采用2-△△CT法分析mRNA的相对表达量。

8 统计学处理

所得数据均录入SPSS17.0统计学软件中进行分析。实验结果以6次重复实验所得的均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，各组均数间的两两比较用Bonferroni校正的t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 血管紧张素Ⅱ上调人主动脉平滑肌细胞内miR-425表达

血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）是血管重构的关键分子之一[12]。本实验先用Ang Ⅱ刺激HASMCs增殖，并检测miR-425的表达情况。qRT-PCR的结果显示（图1），Ang Ⅱ可时间及剂量依赖性的上调HASMCs中miR-425的表达。

图1 miR-425在HASMCs中表达的qRT-PCR检测。A，Ang Ⅱ浓度依赖性提高细胞活力；B，Ang Ⅱ时间依赖性提高细胞活力；C，Ang Ⅱ浓度依赖性促进细胞中miR-425表达； D，Ang Ⅱ时间依赖性促进细胞中miR-425表达；*0.01＜P＜0.05 vs 0μmol/L; #0.01＜P＜0.05 vs 0h；n=6 Fig. 1 The expression of miR-425 in HASMCs. A, Ang Ⅱ increased cell viability in a dose-dependent manner; B, Ang Ⅱ increased cell viability in a time-dependent manner; C, Ang Ⅱ up-regulated miR-425 expression in a dose-dependent manner; D, Ang Ⅱ up-regulated miR-425 expression in a time-dependent manner; *0.01＜ *P＜0.05 vs 0μmol/L; #0.01＜*P＜0.05 vs 0h; n=6

2 下调miR-425抑制Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖

为进一步确定miR-425对血管重构过程中HASMCs生物学行为的影响，本实验通过转染miR-425 inhibitor 下调细胞中miR-425的表达。转染效率检测显示（图2A），425-i组miR-425的表达下调至对照组的0.39±0.04倍。CCK-8细胞活力分析显示（图2B），下调miR-425可部分逆转Ang Ⅱ所致的细胞活力增加。流式细胞仪细胞周期检测显示（图2C），Ang Ⅱ处理后G0/G1期细胞比例由87.21%±2.37%下降到54.26%±2.34%，与之对应，S期细胞比例由8.07%±1.15%上升到38.63%±2.47%。下调miR-425后Ang Ⅱ处理细胞的G0/G1期比例为70.08%±2.19%，S期比例为20.17%±1.69%。结果表明下调miR-425可显著抑制Ang Ⅱ所致的细胞增殖，阻滞细胞周期由G0/G1期向S期转换。

图2 下调miR-425抑制Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖. A，转染效率检测；B，下调miR-425部分逆转Ang Ⅱ所致的HASMCs活力增加；C，下调miR-425部分逆转Ang Ⅱ所致的HASMCs 周期G1/S转换；*P＜0.01 vs control; #0.01＜P＜0.05 vs Control＋Ang Ⅱ; n=6Fig. 2 Down-regulation of miR-425 inhibited Ang Ⅱ-induced HASMCs proliferation. A, the detection of transfection efficacy; B, knockdown of miR-425 partly reversed Ang Ⅱ-induced HASMCs viability increase; C, knockdown of miR-425 partly reversed Ang Ⅱ-induced HASMCs cell cycle G1/S transition (flow cytometry detection); D, statistical analysis for the results of flow cytometry detection; *P＜0.01 vs Control; 0.01＜#P＜0.05 vs Control＋ AngⅡ; n=6

3 下调miR-425抑制HASMCs迁移

本实验还进一步采用Transwell实验检测了下调miR-425对HASMCs细胞迁移能力的影响。结果显示（图3），下调miR-425后细胞的迁移率由对照组的100% ± 3.34 %下降至62.04% ± 3.47%，即下调miR-425可显著抑制HASMCs的迁移。

图3 下调miR-425抑制HASMCs迁移. *P＜0.01 vs Control; n=6；比例尺，100μmFig. 3 Down-regulation of miR-425 inhibited HASMCs migration. *P＜0.01 vs Control; n=6; scale bar, 100μm

4 下调miR-425抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路活性

为了探讨下调miR-425抑制HASMCs增殖及迁移的潜在分子机制，采用Western blot检测了下调miR-425对细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路活性的影响。Western blot检测显示，相对于Control组细胞，转染miR-425 inhibitor之后PI3K、p-Akt及MMP-9水平均显著降低，而PTEN水平则明显升高。结果表明，下调miR-425可抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路的活性。

图4 下调miR-425抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路的活性. *0.01＜P＜0.05 vs Control; n=6Fig. 4 Down-regulation of miR-425 inhibited the activity of PTEN/PI3K/Akt pathway. *0.01＜P＜0.05 vs Control; n=6

讨 论

血管平滑肌细胞过度增殖是心血管疾病进展中血管重构的关键因素之一，为系统分析miR-425对HASMCs增殖及迁移等生物学行为的影响，本实验首先通过Ang Ⅱ刺激HASMCs增殖，并检测该过程中miR-425的表达情况，结果显示Ang Ⅱ可时间及剂量依赖性的促进HASMCs中miR-425的表达。众所周知，Ang Ⅱ可经多条复杂交错的信号通路诱导血管平滑肌细胞增殖，参与血管重构并最终导致高血压、脑卒中等心血管疾病的发生[12]。本实验的初步检测结果表明，miR-425可能参与调控Ang Ⅱ所致的HASMCs增殖过程。

随后本研究采用miR-425 inhibitor下调HASMCs中内源性miR-425的表达，以进一步分析miR-425在Ang Ⅱ所致细胞增殖中具体作用及潜在机制，结果显示下调miR-425可部分逆转Ang Ⅱ所致的细胞活力增加。细胞增殖与细胞的周期转换密切相关，故而我们通过流式细胞术分析了下调miR-425对HASMCs周期转换的影响，结果显示，Ang Ⅱ可促进HASMCs细胞周期由G0/G1期向S期转化，而下调miR-425可部分逆转该作用。此外，Transwell的实验结果也显示，下调miR-425可抑制HASMCs的迁移。由此可见，miR-425可参与调控人主动脉平滑肌细胞的增殖及迁移等生物学行为。

miRNAs作用的发挥主要是通过靶基因的调控来实现的，已报道的miR-425靶基因包括PTEN、SMAD2、CTNNA3、CCM3、CYLD等[10,13-16]。同时细胞的增殖、周期转换及细胞迁移往往与细胞内一系列信号分子及信号通路的调控密不可分。在众多信号通路中，PTEN/PI3K/Akt是调控细胞生长、分化、凋亡、代谢等的经典通路，PTEN缺失或功能下调会导致PI3K的激活，活化的PI3K可进一步将底物PIP2转化为PIP3，作为第二信使激活该通路下游包括Akt在内的众多信号分子，从而参与调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等病理生理学过程[17,18]。故而本研究分析了下调miR-425对PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响。结果显示，相对于Control组细胞，转染miR-425 inhibitor之后PTEN的蛋白表达明显升高，而PI3K及p-Akt的蛋白表达均显著降低。由此表明，下调miR-425可抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路的活性。MMP-9则是PTEN/PI3K/Akt信号通路下游与细胞迁移密切相关的因子之一[19,20]，下调miR-425也可降低HASMCs中MMP-9的表达水平，这可能是其抑制迁移的潜在机制之一。以上结果说明下调miR-425对HASMCs生物学功能产生的调控作用可能与PTEN/PI3K/Akt信号通路有关，但是两者之间具体的作用机制以及涉及的其他信号分子还有进一步深入的研究。