栾雅静，许海委，徐宝山，杨强

(1天津医科大学，天津 300070；2天津市天津医院)

椎间盘退变是下腰痛发病的最主要原因，利用组织工程学方法修复退变的椎间盘组织，以恢复椎间盘结构和功能，逐渐成为临床治疗下腰痛的研究重点[1]。目前用于构建组织工程椎间盘的种子细胞包括椎间盘纤维环细胞、髓核细胞及骨髓间充质干细胞等[2,3]，但均存在取材困难、对机体损伤较大及来源有限等问题。人脐带间充质干细胞(以下简称脐带干细胞)是存在于脐带组织的一种新型间充质干细胞，其不但具有间充质干细胞的典型特征，还具有与胚胎间充质干细胞相似的高度体外富集和扩增特点；且来源广泛、易于获取、保存方便、无伦理学争议、无免疫排斥反应[4]。研究发现，脐带干细胞能在体外诱导分化为髓核细胞[5]，但目前鲜有关于体外诱导脐带干细胞向纤维环细胞分化的研究。2016年1月～2018年1月，本研究采用体外共培养技术诱导脐带干细胞向纤维环细胞分化，现分析结果并探讨达到最佳诱导效果时二者的比例。

1 材料与方法

1.1 材料 选择天津市天津医院妇产科出生的健康足月顺产胎儿的脐带约30 cm，本研究通过医院医学伦理委员会审核，胎儿父母均知情同意。选择新西兰大白兔2只，3～4 月龄，雌雄不限，体质量(2.5±0.5)kg，来源于天津市天津医院实验动物中心。主要试剂：人Ⅰ型胶原α2、人Ⅱ型胶原α1、人蛋白多糖AGC ELISA试剂盒均购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司， Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710、Anti-Collagen Ⅱ antibody ab34712均购于美国Abcam公司，SYBR Premix Ex Taq试剂盒购于日本TaKaRa公司。主要仪器：iQ5 real-time PCR扩增仪购于美国Applied Biosystems公司，CO2恒温培养箱购于美国Thermo Forma公司，倒置显微镜购于日本Olympus公司，5415D型离心机购于德国Eppendorf公司。

1.2 人脐带干细胞分离和培养 取脐带组织，放入无菌D-Hank′s液中洗去残留血液。将脐带剪成4 cm大小节段，纵行剪开脐带外膜，剥离血管。取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，D-Hank′s液冲洗后，剪切成约1 mm3大小碎块，浸于0.075% Ⅱ型胶原酶溶液中，37 ℃恒温消化18 h，2 500 r/min离心10 min后弃上清。剩余液体用0.25%胰蛋白酶于37 ℃条件下恒温消化30 min，2 500 r/min离心10 min后弃上清。加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，调整细胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。半量换液除去未贴壁细胞，每3天换液1次。

1.3 兔纤维环细胞分离和培养 将2只新西兰大白兔耳缘静脉注射空气处死，无菌条件下取出胸、腰段脊柱。去除软骨终板及周围肌肉、韧带组织，分离椎间盘组织，用D-Hank′s 液漂洗2遍后分离纤维环组织。用剪刀将纤维环组织剪碎成乳糜状，经0.25%胰蛋白酶预消化2 h。加入血清终止胰酶消化，1 000 r/min离心10 min后弃上清。加入0.2 % Ⅱ型胶原酶重悬细胞及组织块，组织块完全消化后过滤，1 000 r/min离心10 min收集沉淀细胞。用含10% FBS的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每2天换液1次。

1.4 人脐带干细胞与兔纤维环细胞共培养 取第二代脐带干细胞消化后制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×104/mL。取第二代兔纤维环细胞消化后制备单细胞悬液，调整细胞密度分别为1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL。将脐带干细胞随机分为0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组，各组均取2×104/mL浓度脐带干细胞单细胞悬液1 mL接种于Transwell 6孔板下层；1∶2组、1∶1组、2∶1组分别取细胞密度为1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL的兔纤维环细胞单细胞悬液1 mL接种于Transwell 6孔板上层，使纤维环细胞与脐带干细胞的比例分别为1∶2、1∶1、2∶1。加入培养液，通过0.4 μm的微孔滤膜相通形成共培养，培养14天。

1.5 脐带干细胞向纤维环细胞分化的诱导效果观察

1.5.1 各组脐带干细胞形态学变化 培养14天，收集各组脐带干细胞，倒置显微镜下观察脐带干细胞形态变化。

1.5.2 各组脐带干细胞中纤维环细胞相关基因Ⅰ型胶原、蛋白聚糖mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。培养14天，收集各组脐带干细胞，加入细胞裂解液进行裂解，采用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书检测Ⅰ型胶原、蛋白聚糖mRNA相对表达量。Ⅰ型胶原上游引物：5′-TGCTCGTGGAAATGATGGTG-3′，下游引物：5′-CCTCGCTTTCCTTCCTCTCC-3′，引物长度450 bp。蛋白聚糖上游引物: 5′-AAGGGCGAGTGGAATGATGT-3′，下游引物：5′-CGTTTGTAGGTGGTGGCTGTG-3′，引物长度100 bp。内参β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物： 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3 ′，引物长度501 bp。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔC法计算Ⅰ型胶原、蛋白聚糖 mRNA相对表达量。

1.5.3 各组脐带干细胞中纤维环细胞相关基因Ⅰ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达检测 ①采用ELISA法。培养14天，收集各组脐带干细胞，采用预冷的PBS冲洗5 min×3次。每1×106个细胞中加入200 μL PBS，重悬并反复冻融使细胞破碎，1 500 r/min离心10 min，取上清液。采用ELISA法检测Ⅰ型胶原、蛋白聚糖表达，严格按照试剂盒说明书操作。②采用免疫细胞化学染色法。培养14天，取各组脐带干细胞爬片后PBS冲洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶室温10 min；PBS冲洗5 min×3次；0.25%Triton X-100室温孵育标本10 min，冲洗5 min×3次；加入10%羊血清室温条件下封闭30 min，甩去血清。加入Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710(稀释比例为1∶300)，4 ℃孵育过夜；加入羊抗兔二抗(稀释比例为1∶300)，室温条件下孵育1 h。PBS冲洗5 min×3次，加入SABC复合物，室温下作用30 min～1 h。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明20 min，中性树胶封固。200倍光镜下采用半定量积分法判定结果，即根据每张切片的阳性细胞比例及着色程度进行评分。阳性细胞比例评分：阳性细胞数<10%为1分，10%～30%为2分，>30%为3分；着色程度评分：未着色为0分，浅棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分。将两项得分结果相乘，0为阴性，1～2为弱阳性，3～4为阳性，4以上为强阳性。

2 结果

2.1 各组脐带干细胞形态学变化比较 0∶1组脐带干细胞多呈长梭形。1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞形态逐渐变为短梭形或多角形，细胞出现多个突起，局部区域相邻细胞突起连成网状；随着纤维环细胞的比例升高，脐带干细胞上述变化越明显，越接近纤维环细胞的形态学特征，2∶1组纤维环细胞的形态学特征最明显。

2.2 各组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖 mRNA相对表达量比较 0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖 mRNA相对表达量均依次升高，两组间比较P均<0.01。见表1。

表1 各组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖 mRNA相对表达量比较

注：与0:1组比较，aP<0.01；与1∶2组比较，bP<0.01；与1∶1组比较，cP<0.01。

2.3 各组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达比较 0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖表达均依次升高，两组间比较P<0.05或<0.01。见表2。0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达分别呈阴性、弱阳性、阳性及强阳性。

表2 各组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达比较

注：与0∶1组比较，aP<0.01；与1∶2组比较，bP<0.05，cP<0.01；与1∶1组比较，dP<0.01。

3 讨论

研究证实，脐带干细胞是一种多潜能成体干细胞，具有多向分化潜能。脐带干细胞可分化为脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、骨骼肌细胞等[6～8]；经体外诱导后可分化为椎间盘样细胞[9]，且间充质干细胞和椎间盘细胞共培养后能明显促进椎间盘细胞外基质合成[10]。本研究结果显示，当纤维环细胞与脐带干细胞共培养时，脐带干细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形或多角形，并开始出现细胞突起，出现纤维环细胞的形态学特征，进一步证实二者共培养可诱导脐带干细胞向纤维环细胞分化。

目前关于纤维环细胞通过共培养技术诱导脐带干细胞分化的最适诱导浓度尚不明确，以往的研究多采用1∶1的细胞比例。张燕等[11]报道，采用细胞比例为1∶1的共培养体系能诱导脐带干细胞向NP细胞分化。张明等[12]报道，骨髓间充质干细胞与纤维环细胞按1∶1比例共培养后，骨髓间充质干细胞具有向纤维环细胞分化的可能。本研究将纤维环细胞与脐带干细胞按照不同比例进行共同培养，结果显示，纤维环细胞与脐带干细胞共培养时，纤维环细胞的比例越高，脐带干细胞出现的纤维环细胞的形态学特征越明显；当二者比例为2∶1时诱导效果最佳。Ⅰ型胶原和蛋白聚糖是纤维环细胞的主要成分，目前均为作为纤维环细胞的标记物。Ⅰ型胶原和蛋白聚糖是关节盘行使功能的主要细胞外基质成分，且蛋白聚糖在关节盘中间带承受压缩力过程中起重要作用[13]。研究发现，Ⅰ型胶原和蛋白聚糖基因在纤维环细胞中呈高表达，而在脐带干细胞中呈低表达，故诱导后脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖基因表达在一定程度上可反映脐带干细胞向纤维环细胞分化的程度。本研究结果显示，0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原、蛋白聚糖 mRNA相对表达量及Ⅰ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达均依次升高，两组间比较差异均有统计学意义。说明纤维环细胞与脐带干细胞共培养可促进脐带干细胞表达纤维环细胞相关基因，并分泌纤维环细胞相关细胞基质，且纤维环细胞与脐带干细胞比例为2∶1时效果最明显。

纤维环细胞成分主要以Ⅰ型胶原蛋白为主，而髓核细胞则以Ⅱ型胶原蛋白为主。Ⅰ型胶原蛋白使纤维环细胞具有较好的张力，有助于维持细胞形态，更好地承受来自脊柱不同方向的牵引力。本研究结果显示，0∶1组、1∶2组、1∶1组、2∶1组脐带干细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达分别呈阴性、弱阳性、阳性及强阳性；提示脐带干细胞与纤维环细胞共培养可诱导脐带干细胞分化为纤维环细胞，并使其具备合成Ⅰ型胶原蛋白的能力，且纤维环细胞与脐带干细胞比例为2∶1时的效果最明显。

综上所述，纤维环细胞与脐带干细胞共培养能诱导脐带干细胞向纤维环细胞分化，二者共培养的最佳比例为2∶1。