陈林建，李朝晖，罗真

(广东医科大学附属佛山禅城中心医院，广东佛山528031)

骨关节炎是以关节软骨退变为特征的老年常见疾病，以膝骨关节炎(KOA)最为常见。研究证实，关节软骨细胞数量减少和软骨基质降解是KOA的主要病理改变[1]，软骨细胞凋亡和自噬在KOA的发病过程中发挥重要作用[2,3]。miRNA是一类长度为20～24 nt高度保守的小分子非编码RNA，通过对靶基因表达的调控参与细胞增殖、分化、凋亡、自噬等一系列重要生理及病理过程[4～6]。let-7家族是最先被鉴定的miRNA之一，let-7a是该家族的成员。目前关于let-7a在KOA患者软骨细胞中的表达及其作用机制尚不清楚。为此，我们于2016年6月～2017年6月进行了如下研究。

1 材料

膝关节软骨组织：KOA软骨组织取自我院行膝关节置换术的40例KOA患者(男12例、女28例，年龄64～75岁，均符合2007年中华医学会骨科学分会制定的KOA诊疗指南诊断标准[7]，排除因其他疾病行膝关节置换术者)，为其膝关节软骨外漏区边缘的软骨退变组织。正常膝关节软骨组织标本取自同期因创伤于我院行下肢截肢手术的15例患者(男10例、女5例，年龄16～40岁，均为非KOA患者，既往膝关节功能正常)。膝关节软骨细胞：取部分KOA软骨组织及正常软骨组织，参考文献[8,9]的方法，用含青霉素、链霉素双抗的冰冷PBS冲洗3遍，无菌眼科小剪刀剪成大小约为1 mm×1 mm×1 mm的碎块。加入0.25 %胰蛋白酶，置于37 ℃培养箱中振荡消化40 min，弃上清液，加入Ⅱ型胶原酶，37 ℃培养箱中振荡消化4～6 h。3 000 r/min离心10 min，收集细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2～3天换液1次，细胞融合至85%左右时进行消化传代，取传2代细胞用于后续实验。主要试剂：胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Hyclone公司，TRIzol试剂购自北京雷根生物技术有限公司，Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，M-MLV逆转录试剂盒购自美国Promega公司，SYBR Premix EX Taq(Perfect Real time染料法)实时荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司，Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，抗微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体、抗Beclin1抗体均购自美国Santa Crus公司，抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体均购自上海生工生物工程有限公司，HRP标记的二抗购自美国BioWorld公司。let-7a模拟物let-7a mimics及阴性对照NC-mimics均购自上海吉玛制药技术有限公司，let-7a及U6引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

2 方法与结果

2.1 软骨组织及软骨细胞let-7a mRNA表达检测

2.1.1 软骨组织let-7a mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。分别取部分KOA软骨组织及正常软骨组织100 mg，充分研磨后加入TRIzol试剂提取组织总RNA，应用紫外分光光度计对每个样本提取总RNA的A260/A280进行测定，证实符合实验要求。按M-MLV逆转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，参照SYBR Premix EX Taq实时荧光定量试剂盒说明书配置反应体系，应用实时荧光定量PCR仪进行检测。let-7a上游引物：5′-GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。内参U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：94 ℃、10 s，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算let-7a mRNA相对表达量。结果显示，KOA软骨组织及正常软骨组织let-7a mRNA相对表达量分别为0.48±0.18、1.02±0.07，二者比较P<0.01。

2.1.2 软骨细胞let-7a mRNA表达检测 分别取KOA软骨细胞及正常软骨细胞各1×107个，加入细胞裂解液进行裂解，参照2.1.1采用实时荧光定量PCR法检测let-7a mRNA相对表达量。结果显示，KOA软骨细胞及正常软骨细胞let-7a mRNA相对表达量分别为0.29±0.13、0.98±0.05，二者比较P<0.01。

2.2 let-7a过表达对KOA软骨细胞凋亡及自噬影响的观察

2.2.1 let-7a过表达的KOA软骨细胞模型建立 取生长状态良好的KOA软骨细胞接种于6孔板，接种密度为3×105个/孔，待细胞融合60%～80%时随机分为let-7a过表达组及对照组，分别采用Lipofectamine2000转染let-7a mimics及NC-mimics，转染6 h更换新鲜培养液；转染48 h收集两组细胞，参照2.1.1采用实时荧光定量PCR法检测let-7a mRNA相对表达量。结果显示，let-7a 过表达组及对照组细胞 let-7a mRNA相对表达量分别为14.84±0.58、1.01±0.06，两组比较P<0.01。证实let-7a过表达的KOA软骨细胞模型成功建立。

2.2.2 let-7a过表达的KOA软骨细胞凋亡能力检测 采用流式细胞术。收集let-7a过表达组及对照组转染48 h后的细胞，PBS冲洗2遍，以不含EDTA的胰蛋白酶消化后，离心收集细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL。取100 μL细胞悬液置于流式管中，加入10 μL Annexin V-FITC溶液和 5 μL碘化丙啶(PI)混匀，冰浴、暗处静置10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，let-7a 过表达组及对照组细胞凋亡率分别为(5.41±1.43)%、(18.52±4.21)%，两组比较P<0.01。

2.2.3 let-7a过表达的KOA软骨细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及自噬相关蛋白LC3(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ)、Beclin1表达检测 采用Western blotting法。收集let-7a 过表达组及对照组转染48 h的细胞，PBS冲洗3遍，加入细胞裂解液和1%蛋白酶抑制剂，冰上处理20 min。4 ℃条件下离心15 min，收集上清液，BCA法进行蛋白定量。两组分别取30 μg蛋白上样，经SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭。加入Bax、Bcl-2、LC3、Beclin1和GAPDH一抗(稀释倍数均为1∶500)，4 ℃孵育过夜，洗膜；加入二抗(稀释倍数均为1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜。ECL染色，拍照后对蛋白条带灰度值进行分析。以Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1与GAPDH蛋白条带灰度值的比值计算蛋白相对表达量，并计算Bcl-2/Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。结果显示，let-7a 过表达组Bax蛋白相对表达量低于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax均高于对照组，两组比较P均<0.01。见表1。let-7a过表达组LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相对表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于对照组，LC3Ⅰ蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.05)。见表2。

表1 let-7a过表达组及对照组Bax、Bcl-2蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

表2 let-7a过表达组及对照组LC3、BedLin蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

miRNA通过调控靶基因表达而参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，在多种疾病的发生、发展中发挥关键作用[10,11]。研究发现，与正常膝关节软骨组织相比，许多miRNA在骨关节炎患者软骨组织中存在差异表达[12]；骨关节炎不同病情者软骨组织中miRNA表达亦存在差异[13]，提示miRNA在骨关节炎的发生、发展过程中可能具有重要作用。let-7a属于let-7家族的重要成员，目前已经发现其在白内障晶状体上皮细胞、阿尔茨海默病神经细胞以及骨关节炎滑膜液等老年退行性疾病中表达异常[14～16]。本研究结果显示，KOA软骨组织及KOA软骨细胞let-7a mRNA相对表达量均低于正常软骨组织及正常软骨细胞，提示let-7a可能与KOA的发生密切相关。

关节软骨退变是骨关节炎发病机制的中心环节，软骨细胞衰老凋亡是其最主要的病理表现[17]。既往研究表明，骨关节炎的一系列病理生理过程，如软骨形成和分化、软骨基质降解以及软骨细胞增殖、凋亡、自噬等过程几乎均有miRNA的参与[18]。Zhang等[19]研究发现，miR-210能够通过靶向DR6抑制NF-κB活性抑制软骨细胞凋亡。Huang等[20]证实，miR-337-3p能够通过调控PTEN/AKT通路促进OA软骨细胞增殖并抑制其凋亡。Bcl-2是Bcl-2家族中最重要的凋亡抑制因子，Bax与其功能相反，是重要的凋亡促进因子。Bcl-2/Bax是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，可反映细胞凋亡情况。本研究结果显示，let-7a过表达组细胞凋亡率、Bax蛋白相对表达量均明显低于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax均高于对照组；证实上调软骨细胞let-7a表达可抑制其凋亡。

细胞自噬亦称Ⅱ型程序性细胞死亡，是机体在生理或病理条件下的应激反应，通过溶酶体清除受损或老化的细胞器，并将其转化为新的能量物质，从而维持机体内环境的稳定。自噬是正常软骨细胞的保护或平衡机制，细胞自噬水平下降在骨关节炎的发生、发展中具有重要作用[21]。Caramés等[22]研究发现，骨关节炎小鼠模型中自噬相关蛋白ULK1、Beclin1和LC3表达均明显降低。Cheng等[23]证实，软骨细胞自噬水平下降与骨关节炎密切相关，提高细胞自噬水平可延缓骨关节炎进展，对软骨组织具有重要的保护作用。骨关节炎软骨细胞的自噬水平较正常软骨细胞明显降低，许多miRNA可通过调控软骨细胞的自噬水平而调节骨关节炎进展[24～26]。目前研究通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ评估细胞的自噬水平。Beclin-1基因是酵母菌ATG6同源体，其表达水平与自噬水平呈正相关，亦是反映细胞自噬水平的常用指标。本研究结果显示，let-7a 过表达组LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相对表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于对照组，LC3Ⅰ蛋白相对表达量低于NC-mimics组；说明上调KOA软骨细胞let-7a表达可促进其自噬。

综上所述，let-7a在KOA患者软骨组织、软骨细胞中的表达均降低；上调let-7a表达能促进软骨细胞自噬并抑制其凋亡，从而发挥软骨保护作用。let-7a可能成为KOA治疗的一个潜在靶点。