唐芳，马武开，周静，卢向阳，陈琳英，兰维娅，李宇，蒋总

(1贵阳中医学院第二附属医院，贵阳550001；2贵阳中医学院)

膝骨关节炎是由多种原因引起的以关节软骨退变和骨质增生为主要病理变化的一种慢性疾病[1,2]。目前膝骨关节炎的病因尚不清楚，可能与软骨细胞自我吞噬、机械力学改变、氧化应激、内部免疫、软骨过度增生、疼痛等因素有关[3]。研究显示，Wnt/β-catenin信号通路是参与关节软骨细胞分化、成熟及凋亡的重要信号通路，在膝骨关节炎发生中发挥重要作用[4～6]。中药塌渍疗法具有温经通络、破瘀散结的功效，加上热力作用可使药物成分通过皮肤直接吸收，经穴渗透扩散，直达病所，从而发挥治疗作用[7,8]。2016年4月～2017年10月，本研究观察了活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨关节炎的临床效果，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康新西兰大白兔72只，4～5月龄，体质量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由贵阳中医学院动物实验中心提供。实验药物：活血通痹汤为贵阳中医学院风湿免疫科以贵州苗药为主要组成成分的临床经验方，药物组成为透骨香(30 g)、透骨草(30 g)、黑骨藤(30 g)、海桐皮(50 g)、白芷(20 g)、乳香(20 g)、没药(20 g)、川芎(30 g)、防风(20 g)、红花(20 g)、当归(20 g)、大血藤(60 g)、白芍(60 g)；双氯芬酸二乙胺乳膏(扶他林软膏，永信药品工业昆山股份有限公司)。主要试剂：TRIzol总RNA提取试剂购于天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker均购于日本TaKaRa公司，组织蛋白抽提试剂盒、RIPA Lysis Buffer (Strong)、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE loading buffer、Wester blotting ladder pen均购于康为世纪生物科技有限公司。

1.2 动物分组与建模 将72只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、扶他林组、42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、32 ℃塌渍组，每组12只。除空白组外，其余5组均采用关节制动法[9]建立兔右侧膝骨关节炎模型，方法如下：将兔右侧膝关节用管型石膏和小铝板固定于伸直位，行右侧肢体膝部管型石膏的开窗处理，限制兔关节活动，造成膝关节压力异常，形成进行性膝骨关节炎，建模时间为4周。建模期间各组均正常饲养。

1.3 治疗方法 建模第5周，扶他林组右侧膝关节外用扶他林软膏，每次约10 mg均匀外涂于右侧膝关节，并轻轻揉搓至药物完全吸收，1次/d。42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、32 ℃塌渍组均采用活血通痹汤塌渍疗法治疗。方法如下：将活血通痹汤原药浸泡半小时，加入适量水，放入锅中煮沸，将药液转移至恒温锅中，42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、32 ℃塌渍组分别将恒温锅内药物维持温度调整为42、37、32 ℃；各组取纱布浸泡于不同温度药液中，将纱布敷于患膝，每2～4 min更换一次纱布，尽量保持温度维持不变；三组治疗时间均为20 min，1次/d。

1.4 相关指标观察

1.4.1 膝关节软骨表面大体情况及软骨组织病理改变 治疗28天采用空气栓塞法处死各组动物，取出右侧膝关节，肉眼大体观察软骨表面大体情况。取部分膝关节软骨组织，常规HE染色后光镜下观察软骨组织病理改变，其余膝关节软骨组织置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.4.2 膝关节软骨组织Wnt蛋白(Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a ) mRNA表达 采用real-time PCR法检测。取-80 ℃保存的膝关节软骨组织约50 μg放入研钵中，充分剪碎后加入液氮反复研磨，待组织完全成粉末状。采用TRIzol总RNA提取试剂盒提取总RNA，NanoDrop®ND-2000检测RNA浓度和纯度合格后，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录合成cDNA。将所有cDNA样品配置real-time PCR反应体系，于real-time PCR仪上进行反应。Wnt3a上游引物：5′-ACGACAGCGCCTCGGAGATGG-3′，下游引物：5′-GGTTGGGCTCGCAGAAGTTGG -3′，引物长度150 bp；Wnt5a上游引物：5′-TGCCACTTGTATCAGGACCAC-3′，下游引物：5′-GCTGCCTATCTGCATCACTCT-3′，引物长度150 bp；Wnt7a上游引物：5′-CATCGGCTTCGCCAAGGTCT-3′，下游引物：5′-GCACTCCAGCTTCATGTTCTC-3′，引物长度124 bp；内参18srRNA上游引物：5′-TCTGTGATGCCCTTAGATGTCG-3′，下游引物：5′-AATGGGGTTCAACGGGTTAC-3′，引物长度104 bp。采用2-ΔΔCt法计算Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量。

1.4.3 膝关节软骨组织连环素蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表达 采用Western blotting法检测。取-80 ℃保存的膝关节软骨组织约50 μg，充分研磨后提取软骨细胞蛋白。BCA定量试剂盒检测提取的蛋白浓度，根据目的蛋白分子量大小，选择10%的分离胶浓度。样品加入上样缓冲液后100 ℃加热3 min，每孔上样20 μL总蛋白进行SDS-PAGE，电泳后半干转蛋白至裁剪好的电转膜上。转膜结束，取下PVDF膜，放入TBST中，摇床洗膜10 min/次，共2次。将PVDF膜浸泡于封闭液中，摇床封闭2 h。加入β-catenin、GSK-3β或β-actin一抗(稀释比例分别为1∶5 000、1∶500、1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(稀释比例均为1∶200)，室温下摇床孵育3 h。TBST充分洗涤PVDF膜3～5次，每次5 min。ECL发光试剂盒显影、拍照，对杂交带进行密度扫描分析。以β-actin为内参，以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值计算β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组膝关节大体情况及病理改变比较 ①关节软骨表面大体情况：空白组关节软骨表面光滑，有光泽且富有弹性，未见裂痕，未见明显肿胀、增生及滑膜充血。模型组关节软骨表面粗糙不平整，色泽暗淡，软骨较薄伴有糜烂，可见明显肿胀、增生及滑膜充血。其他各组关节表面大体情况均优于模型组，但差于空白组；42 ℃塌渍组关节表面较光滑，可见轻度肿胀及滑膜充血；扶他林组及37 ℃塌渍组、32 ℃塌渍组关节软骨表面均不平整，伴有肿胀及滑膜充血。②软骨组织病理改变：空白组软骨细胞数量较多，分布均匀，排列整齐，潮线完整。模型组软骨较薄，表面粗糙，伴有列缺，细胞数目较少，排列紊乱，局部聚集明显，染色不明显，潮线模糊。其他各组在软骨细胞数目、分布、染色情况及潮线等方面均优于模型组，但差于空白组；42 ℃塌渍组软骨细胞数目较多，分布较均匀，可染色，潮线模糊但有层次；37 ℃塌渍组、扶他林组、32 ℃塌渍组软骨细胞数量较少，分布比较乱，有局部细胞积聚，潮线较模糊。

2.2 各组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表达比较 空白组、42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、扶他林组、32 ℃塌渍组、模型组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量均依次升高，两两比较P均<0.05。见表1。

表1 各组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与32 ℃塌渍组比较，cP<0.05；与37 ℃塌渍组比较，dP<0.05；与42 ℃塌渍组比较，eP<0.05。

2.3 各组膝关节软骨组织β-catenin、GSK-3β蛋白表达比较 空白组、42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、扶他林组、32 ℃塌渍组、模型组膝关节软骨组织软骨组织β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量均依次升高，两两比较P均<0.05。见表2。

表2 各组膝关节软骨组织β-catenin、GSK-3β蛋白表达比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与32 ℃塌渍组比较，cP<0.05；与37 ℃塌渍组比较，dP<0.05；与42 ℃塌渍组比较，eP<0.05。

3 讨论

膝骨关节炎发病机制尚不清楚，临床缺乏有效的治疗方法，只能以缓解临床症状、延缓关节破坏为主[10,11]。扶他林为治疗膝骨关节炎的常用药，临床常用其缓解疼痛。膝骨关节炎在中医属于“痹病”，中医认为其病机为肝肾亏虚、筋脉失养，风寒湿之邪侵袭人体，气血阻滞经络，或过劳，或跌打损伤致瘀血阻络。我国传统中医药治疗膝骨关节炎的方法很多，其中塌渍疗法的应用已有上千年历史，其作用原理为热力作用有助于打开皮肤毛孔, 药物成分可通过皮肤吸收，从而改善血液循环，发挥消肿止痛和祛风祛湿作用。活血通痹汤根据患者的病情辨证组方，具有活血化瘀、通络止痛、强筋健骨的作用，既往有研究采用活血化瘀药物溻渍疗法治疗骨关节炎临床效果较好、不良反应较少[12,13]。本研究结果显示，与模型组比较，扶他林组及各温度塌渍组治疗后关节组织病理改变均有所改善，但42 ℃塌渍组改善最明显。证实活血通痹汤塌渍疗法治疗膝骨关节炎效果较好， 42 ℃条件下的治疗效果最佳。

Wnt/β-catenin信号通路为Wnt信号通路中的经典通路[14]，该信号通路在早期胚胎发育、细胞增殖分化和凋亡、器官形成以及肿瘤形成中均发挥重要作用[15]。Wnt/β-catenin信号通路主要包括Wnt蛋白、跨膜受体(Frizzled)、散乱蛋白(Dsh)、轴蛋白(Axin)、GSK-3β、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、β-catenin及T细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)等[16]。Wnt信号通路传导过程中的重要组成部分是Wnt家族蛋白，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a、Wnt10a等已被证实是参与Wnt信号通路激活的上游基因[17]。β-catenin是Wnt信号通路中的关键成员[18]，在正常细胞中的表达水平较低。当Wnt信号通路被激活时，Wnt蛋白与细胞膜上的特异性受体蛋白结合，活化胞质内蓬乱蛋白(dishevelled、Dsh或Dvl)，抑制由β-catenin、Axin、GSK-3β、APC等组成的降解复合物合成，导致β-catenin磷酸化水平降低；β-catenin在细胞质内浓度逐渐升高，达到一定浓度后转入细胞核内与TCF/LEF结合，激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13、骨形成蛋白2等表达，从而促进软骨细胞增殖、分化与凋亡[19～21]。这个降解复合体中，GSK-3β发挥主要作用，GSK-3β可以促进β-catenin磷酸化，导致磷酸化的β-catenin经泛素化和蛋白酶体降解[22]。当无Wnt信号时，β-catenin与Axin、GSK-3β、APC等形成降解复合物，使β-catenin被磷酸化，无法激活下游基因表达，因此其在正常软骨细胞中的表达水平较低。本研究结果显示，空白组、42 ℃塌渍组、37 ℃塌渍组、扶他林组、32 ℃塌渍组、模型组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量及β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量均依次升高，两组间比较差异均有统计学意义；说明活血通痹汤溻渍疗法治疗兔膝骨关节炎的相关机制可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路传导有关；且42 ℃条件下对软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路相关因子表达的抑制作用最强。活血通痹汤塌渍疗法可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路上相关因子的表达而调控软骨细胞增殖、分化和凋亡，从而控制膝骨关节炎的疾病进展，但是其具体的调控机制仍需进一步探讨。

综上所述，活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨关节炎的效果较好，42 ℃条件下的治疗效果最佳；其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。