王涛，刘一泽，冯健洲，周禹伯，申德伟，王勇

(沈阳医学院附属中心医院，沈阳 110024)

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤之一，好发于长骨干骺端[1,2]。骨肉瘤患者的5年生存率为30%～75%，多数患者的最终死因为肿瘤复发或远处转移[3,4]。长链非编码RNA (lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA，其在X染色体沉默、 基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程中均发挥重要作用[5,6]。近年研究发现，lncRNA在骨肉瘤等多种肿瘤组织中异常表达，并与肿瘤细胞侵袭、转移有关[7]。lncRNA肺腺癌转移相关转录物1(lncRNA MALAT1)在多种肿瘤的发生过程中发挥癌基因作用，但是目前关于其在骨肉瘤中的作用鲜见报道。为此，我们于2017年9月～2018年3月进行了如下研究。

1 材料

细胞：人骨肉瘤细胞株MG-63(简称骨肉瘤细胞)、人成骨细胞系hFOB1.19(简称成骨细胞)均购自中科院上海细胞库(将骨肉瘤细胞置于DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养；成骨细胞置于DMEM/F12培养基中，34 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养；以上两种培养基中均添加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素，待两种细胞融合率达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化并传代)。主要试剂：DMEM培养基购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒及LipofectamineTM3000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，SYBR Master Mixture购自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量试剂盒购自中国江苏凯基生物技术股份有限公司，anti-GAPDH一抗、anti-ROCK1一抗及HRP标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司，Transwell小室购自美国Corning公司。主要质粒：MALAT1沉默质粒MALAT1-siRNA及其对照质粒con-siRNA、ROCK1过表达载体质粒oe-ROCK1及其对照质粒pcDNA均由广州锐博公司设计合成。

2 方法与结果

2.1 骨肉瘤细胞与成骨细胞lncRNA MALAT1表达检测 采用qRT-PCR法。取生长状况良好的骨肉瘤细胞与成骨细胞，加入细胞裂解液进行裂解，参照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，按照Invitrogen试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA。采用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒在荧光定量仪上进行PCR反应。lncRNA MALAT1上游引物：5′-GCGACGAGTTGTGCTGCTATCT-3′，下游引物：5′- ACACTGCTCTGGGTCTGCTTTT-3′； 以β-actin为内参，β-actin上游引物：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。 PCR反应条件： 95 ℃预变性15 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共45个循环。以lncRNA MALAT1与β-actin条带灰度值的比值计算lncRNA MALAT1相对表达量。结果显示，骨肉瘤细胞与成骨细胞lncRNA MALAT1相对表达量分别为6.94±0.63、1.43±0.24，二者比较P<0.01。

2.2 lncRNA MALAT1沉默对骨肉瘤细胞侵袭能力及ROCK1蛋白表达的影响

2.2.1 骨肉瘤细胞MALAT1沉默模型建立 取生长状况良好的骨肉瘤细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，调整细胞密度为2×105个/孔，随机分为MALAT1沉默组和MALAT1非沉默组，培养24 h后分别参照LipofectamineTM3000说明书转染MALAT1-siRNA质粒及con-siRNA质粒。转染48 h采用qRT-PCR法(具体步骤参照2.1)检测两组lncRNA MALAT1表达。结果显示MALAT1沉默组和MALAT1非沉默组lncRNA MALAT1相对表达量分别为0.69±0.18、1.27±0.36，证实骨肉瘤细胞lncRNA MALAT1沉默模型建立。

2.2.2 沉默MALAT1表达的骨肉瘤细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。参照Transwell小室说明书，常规包被底部膜，水化；取转染48 h的MALAT1沉默组和对照组细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，分别接种于Transwell上室中。上室内加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，下室内加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉签擦去Transwell小室内部细胞，冲洗、固定、染色后倒置显微镜下观察并计数穿膜细胞数。每组铺6个Transwell 小室，取其平均值。结果显示MALAT1沉默组和MALAT1非沉默组穿膜细胞数分别为(54±9)、(134±16)个，两组比较P<0.01。

2.2.3 沉默MALAT1的骨肉瘤细胞ROCK1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取转染48 h的MALAT1沉默组和MALAT1非沉默组细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取200 μL样品进行SDS-PAGE，转膜。封闭1 h后，分别加入anti-ROCK1一抗(稀释比例为1∶2 000)或anti-GAPDH一抗(稀释比例1∶500)，孵育过夜；次日加入HRP标记的羊抗兔二抗(稀释比例为1∶2 000)，孵育1 h。参照ECL试剂盒说明书行电化学发光检测，采用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以ROCK1与GAPDH蛋白条带灰度值的比值计算ROCK1蛋白相对表达量。 结果显示，MALAT1沉默组和MALAT1非沉默组ROCK1蛋白相对表达量分别为0.36±0.07和1.06±0.11，两组比较P<0.01。

2.3 ROCK1过表达对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响

2.3.1 过表达ROCK1的骨肉瘤细胞模型建立 胰酶消化后接种于6孔板中，调整细胞密度为2×105个/孔。将骨肉瘤细胞随机分为MALAT1沉默组、对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组、MALAT1沉默+ROCK1对照组，培养24 h后分别参照LipofectamineTM3000说明书转染MALAT1-siRNA质粒、con-siRNA质粒、MALAT1-siRNA+oe-ROCK1质粒、MALAT1-siRNA+pcDNA质粒。转染48 h采用Western blotting法(具体步骤参照2.2.3)检测四组ROCK1蛋白相对表达量。结果显示，MALAT1沉默组、对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组、MALAT1沉默+ROCK1对照组ROCK1蛋白相对表达量分别为0.43±0.11、1.21±0.17、1.86±0.27、0.47±0.13。对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组均高于MALAT1沉默组、MALAT1沉默+ROCK1对照组(P均<0.01)；对照组与MALAT1沉默+ROCK1过表达组比较、MALAT1沉默组与MALAT1沉默+ROCK1对照组比较P均>0.05。证实过表达ROCK1的骨肉瘤细胞模型建立。

2.3.2 过表达ROCK1的骨肉瘤细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验(具体步骤参照2.2.2)检测四组细胞侵袭能力。结果显示，MALAT1沉默组、对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组、MALAT1沉默+ROCK1对照组穿膜细胞数分别为(52±7)、(128±14)、(196±14)、(56±7)个；对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组均高于MALAT1沉默组、MALAT1沉默+ROCK1对照组(P均<0.01)；对照组与MALAT1沉默+ROCK1过表达组比较、MALAT1沉默组与MALAT1沉默+ROCK1对照组比较P均>0.05。

3 讨论

越来越多的证据表明，非编码RNA在表观遗传调控中扮演了重要角色[8]。非编码RNA可分为lncRNA和微小RNA，lncRNA是指长度超过200 nt的一大类转录本[9]。MALAT1位于人染色体11q13.1，最初发现时被认为是肺癌侵袭转移相关的标志物之一[10]。Cai等[11]报道，lncRNA MALAT1在骨肉瘤中发挥癌基因的作用，并可作为骨肉瘤治疗的靶基因。Liu等[12]研究发现，lncRNA MALAT1在小细胞肺癌组织及细胞系中表达升高，下调其表达可抑制肺癌ACC-LC-319细胞的侵袭能力。Wang等[13]在一项胃癌的研究中发现，lncRNA MALAT1可通过调控SF2/ASF 通路促进胃癌细胞SGC-7901增殖。Li等[14]报道，lncRNA MALAT1在胰腺癌组织中表达升高，其表达上调可促进胰腺癌的进展。本研究结果显示，骨肉瘤细胞lncRNA MALAT1相对表达量高于成骨细胞，提示MALAT1在骨肉瘤的发生过程中可能发挥癌基因的作用。本研究MALAT1沉默组MALAT1相对表达量、细胞侵袭能力均低于对照组，提示沉默骨肉瘤细胞lncRNA MALAT1表达可降低其侵袭能力，初步证实lncRNA MALAT1与骨肉瘤细胞侵袭有关。

ROCK1是一种小分子G蛋白[15]。既往研究发现，ROCK1参与了包括结直肠癌、骨肉瘤等肿瘤的局部浸润和淋巴结转移[16,17]。Luo等[18]研究发现，ROCK1在甲状腺癌组织中表达升高并与肿瘤大小、淋巴结转移、远处器官转移、侵及甲状旁腺及血管等密切相关，上调其表达可提高甲状腺癌细胞的侵袭能力。Wang等[19]报道，ROCK1在骨肉瘤中表达升高，通过上调miR-335、下调ROCK1表达可抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。既往研究发现，ROCK1在骨肉瘤组织中表达增高，高表达的ROCK1与骨肉瘤患者预后不良密切相关，而抑制ROCK1表达可降低骨肉瘤细胞的侵袭能力[19～21]。本研究结果显示，对照组、MALAT1沉默+ROCK1过表达组ROCK1蛋白表达及细胞侵袭能力均高于MALAT1沉默组、MALAT1沉默+ROCK1对照组；提示在lncRNA MALAT1沉默的骨肉瘤细胞中转染ROCK1过表达载体质粒oe-ROCK1后，骨肉瘤细胞的侵袭转移能力重新得到了加强，初步证实lncRNA MALAT1对骨肉瘤细胞侵袭能力的调控作用是通过调控ROCK1表达实现的。

综上所述，骨肉瘤细胞lncRNA MALAT1表达升高，lncRNA MALAT1可能通过调控ROCK1表达而参与骨肉瘤细胞侵袭。骨肉瘤的侵袭转移是一个涉及多通路多因子多机制的复杂的生物学行为过程，本研究仅初步探讨了lncRNA MALAT1在骨肉瘤细胞MG-63中的表达及其对ROCK1介导的MG-63细胞侵袭转移的影响，而lncRNA的作用机制比较复杂，MALAT1参与ROCK1介导的骨肉瘤细胞侵袭转移的具体作用机制还有待于进一步深入研究。