陈敏,杨晓凤,宋君

(1.四川省农业科学院分析测试中心，成都 610066；2.四川省农业科学院质量标准与检测技术研究所，成都 610066)

大蒜作为日常生活中常见的调味品，历史悠久，而大蒜的特殊风味源于大蒜中的含硫化合物。近年来大蒜越来越多的功效被发现，它被誉为“天然的养生化妆品”、“天然抗生素”，大蒜在改善糖代谢、心血管疾病、防癌治癌等方面有积极作用[1]。目前，以大蒜为原料生产的各种保健品层出不穷，主要因为大蒜中含有一类特殊的生物活性物质——大蒜素(allicin)[2]，大蒜素的含量是衡量大蒜及大蒜制品质量的主要指标。然而，大蒜素要从大蒜中提取出来的，首先需要经过酶解过程，且大蒜素易挥发、不稳定，所以影响大蒜素提取率的因素有很多，例如酶解温度、pH值、提取溶剂、体积、温度、时间等。大蒜素主要成分二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)的分子量均在200以内，本文采用气相色谱法测定大蒜素，用标准NY/T 1800-2009提供的方法提取大蒜素，由于酶解温度太高等原因，导致提取率不理想。本文着重对影响大蒜素提取率的几个重要因素进行单因素实验，且在定容步骤之前增加了反萃取步骤，旨在提高大蒜素的提取率，为测定大蒜及大蒜制品中大蒜素的含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

新鲜无破损市售大蒜；无水乙醇(≥99.7%，四川西陇化工有限公司)；精确pH试纸(上海三爱思试剂有限公司)；0.01 mol/L NaOH、DADS标准品(Chromdex)、DATS标准品(TRC)、正己烷(Fisher Chemical，色谱纯)。

1.2 实验仪器

7890A FID气相色谱仪 Agilent公司；DIKW-4 电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；SHA.B 水浴恒温振荡器 金坛市精达仪器制造有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；IKA○RVORTEX GENIUS3 涡旋仪；R-210 旋转蒸发仪 BUCHI公司；JA2003 电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大蒜素的提取方法

将大蒜去皮洗净，用组织捣碎机捣成蒜泥，取5 g蒜泥，在一定温度和pH值条件下酶解一定时间，后加入一定体积的90%乙醇，在一定条件下振荡提取大蒜素。提取后过滤，取滤液10 mL，加入正己烷反萃取，然后减压浓缩至1～2 mL，最终用正己烷定容到5 mL。

1.3.2 大蒜素的检测方法

1.3.2.1 标准液的配制

称取一定质量大蒜素标准品DADS和DATS，用丙酮配成浓度分别为14908.6，15835.2 mg/L的标准溶液。分别取上述标准溶液1 mL于50 mL容量瓶中，用丙酮稀释到50 mL，配成DADS和DATS浓度分别为298.17，316.70 mg/L的混合溶液。分别取该混合标准溶液5,4,3,2 mL,用正己烷稀释到10 mL，配成一系列浓度的混合标准溶液。采用气相色谱法测定不同浓度下DADS和DATS的峰面积。

1.3.2.2 检测条件

色谱柱：HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；分流比：10∶1；进样口温度：160 ℃；柱温：50～220 ℃；检测器温度：250 ℃；载气流速：2 mL/min；空气流速：400 mL/min；H2流速：40 mL/min。

1.3.2.3 样品中大蒜素的定量

将实验中所得的大蒜素样品用气相色谱法检测，通过外标法(用较近浓度单点定量)计算出大蒜素的浓度，进而计算出大蒜素的提取率。

提取率=大蒜素质量/大蒜质量×100%。

2 结果与讨论

2.1 大蒜素成分分析

大蒜素为淡黄色粉末或淡黄色油状液体，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、苯等有机物，在0.2 kPa时沸点为80～85 ℃[3]。

在新鲜的大蒜中，并不存在大蒜素，其最原始的前体物质是γ-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸。γ-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸在一定条件下水解氧化产生蒜氨酸(alliin)，蒜氨酸在大蒜细胞被破坏时产生不稳定的蒜素，蒜素再分解产生多种挥发性脂溶性化合物DADS(二烯丙基二硫化物)、DAS(二烯丙基硫化物)、DATS(二烯丙基三硫化物)、二烯丙基四硫化合物等含硫化合物，这些硫醚类化合物统称为大蒜素[4]。其中含量最多的是二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)[5]。

2.2 酶解条件对大蒜素提取率的影响实验

大蒜在未破坏之前是不存在大蒜素的，大蒜破坏之后释放其内源酶——蒜酶，在蒜酶作用下蒜氨酸酶解成大蒜素[6]。要尽可能地提取出大蒜中的大蒜素，则首先要使酶解条件最佳。一般来说，植物体内的酶最适温度在40～50 ℃，最适pH值大多在4.5～6.5。参照此条件，设计对比实验。

2.2.1 水对酶解效率的影响

称取2份5 g蒜泥，一份加入10 mL水，一份未加水，调节pH值在6.5，后续步骤参照NY/T 1800-2009，计算出大蒜素的提取率，加水之后的提取率较高，故选择酶解之前加水。

2.2.2 pH值对酶解效率的影响

称取2份5 g蒜泥，加入10 mL水，一份调节pH值在6.5，一份未调节pH值，后续步骤参照NY/T 1800-2009，计算出大蒜素的提取率，调节pH值后的提取率较高，故选择酶解之前调节pH值。

2.2.3 温度对酶解效率的影响

称取4份5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值在6.5，酶解温度分别控制在30,40,50,60 ℃，酶解30 min，后续步骤参照NY/T 1800-2009，计算出大蒜素的提取量,见图1。

图1 酶解温度对大蒜素提取率的影响Fig.1 Effect of enzymatic temperature on the yield of allicin

由图1可知，酶解温度为50 ℃时大蒜素提取率最高，故选择50 ℃为本实验的酶解温度。

2.2.4 酶解时间对大蒜素提取率的影响

称取2份5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值在6.5，在50 ℃时，酶解时间分别控制在30 min和60 min，后续步骤参照NY/T 1800-2009，计算出大蒜素的提取率为30 min和60 min相近，故选择酶解30 min。

2.3 乙醇提取大蒜素的单因素实验

目前，提取大蒜素的方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、超临界提取法等[7]。综合各方法的优缺点以及检测要求，本文采用有机溶剂萃取法[8]。由于大蒜素易溶于乙醇、乙醚、苯等有机物，故采用无毒无害的90%乙醇作为提取溶剂。

2.3.1 料液比对大蒜素提取率的影响

称取4份5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值为6.5，40 ℃酶解30 min，分别加入15,20,25,30 mL 90%乙醇(即料液比分别为1∶3,1∶4,1∶5,1∶6)振荡提取1 h(60 ℃，120 r/min)。抽滤，取10 mL滤液，然后加入20 mL正己烷于滤液中，涡旋2 min，静置，取上清液上机检测，结果见图2。

图2 料液比对大蒜素提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of allicin

由图2可知，用乙醇提取大蒜中的大蒜素，料液比在1∶6时提取率较高。

2.3.2 提取温度对大蒜素提取率的影响

称取5份5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值为6.5，40 ℃酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，分别在40,50,60,65,70 ℃振荡提取1 h(120 r/min)。抽滤取10 mL滤液，然后加入20 mL正己烷于滤液中，涡旋2 min，静置，取上清液上机检测，结果见图3。

图3 提取温度对大蒜素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of allicin

由图3可知，用乙醇提取酶解后大蒜中的大蒜素，提取温度对提取率的影响很大，30～65 ℃呈上升趋势，且速度越来越快，70 ℃时开始下降，所以选择65 ℃作为本实验的提取温度。

2.3.3 提取时间对大蒜素提取率的影响

称取5份5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值为6.5，40 ℃酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，分别振荡提取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h(65 ℃,120 r/min)。抽滤取10 mL滤液，然后加入20 mL正己烷于滤液中，涡旋2 min，静置，取上清液上机检测，结果见图4。

图4 提取时间对大蒜素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of allicin

由图4可知，当提取时间为2 h时，大蒜素提取率较高，故选择提取时间为2 h。

2.4 用正己烷反萃取乙醇中大蒜素的实验

在NY/T 1800-2009 标准中，用5 mL正己烷反萃取15 mL乙醇溶液中的大蒜素。但大蒜素在乙醇中的溶解度比在正己烷中的更大，根据萃取原理，这种情况下的萃取率是不理想的，故设计实验验证萃取体积对大蒜素提取率的影响[9]。

2.4.1 正己烷体积对大蒜素提取率的影响

取大蒜素(DADS,DATS)标准液(用丙酮配制)，先用丙酮稀释成1490.86 mg/L(DADS)和1583.52 mg/L(DATS)的溶液10 mL，再用90%乙醇稀释成一定浓度的混合液。最终二烯丙基二硫化物(DADS)浓度为149.09 mg/L，二烯丙基三硫化物(DATS)浓度为158.35 mg/L(此浓度接近定容后的大蒜素浓度)。准确量取5份该混合液各10 mL于离心管中，分别加入5，10，15，20，25 mL正己烷涡旋2 min。上机检测并计算大蒜素提取率，见图5。

图5 萃取体积对大蒜素提取率的影响Fig.5 Effect of extraction volume on the yield of allicin

提取率随着正己烷体积的增大而增大，增大趋势逐渐减缓，综合提取率和绿色化学两方面考虑，用20 mL正己烷反萃取10 mL乙醇中的大蒜素。

2.4.2 旋蒸温度及真空度对大蒜素提取率的影响

取大蒜素(DADS,DATS)标准液(用丙酮配制)，先用丙酮稀释成1490.86 mg/L(DADS)和1583.52 mg/L(DATS)的溶液10 mL，再用90%乙醇稀释成一定浓度的混合液。最终二烯丙基二硫化物(DADS)浓度为149.09 mg/L，二烯丙基三硫化物(DATS)浓度为158.35mg/L(此浓度接近定容后的大蒜素浓度)。准确量取12份该混合液各10 mL于离心管中，分别加入20 mL正己烷涡旋2 min[10]。其中2份直接上机检测大蒜素浓度，作为理论提取量，另外10份在不同温度和真空度下旋蒸到剩下1～2 mL正己烷，用正己烷定容到5 mL，上机检测，并计算大蒜素提取率，见表1。

表1 大蒜素提取率Table 1 The yeild of allicin

由表1可知，30 ℃，0.075 MPa时，未见明显的旋蒸馏分，故选择在30 ℃，0.078 MPa时旋蒸，损失率最低。

3 结论

3.1 本实验确定的优化方法

称取5 g蒜泥，加入10 mL水，调节pH值到6.5，在50 ℃时酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，65 ℃时，120 r/min在水浴振荡器中振荡提取120 min，抽滤后取10 mL滤液，并加入20 mL正己烷，涡旋2 min，取上层液体，在30 ℃，0.078 MPa时旋蒸至正己烷剩下1～2 mL，用正己烷定容到5 mL，FID上机检测。

3.2 本实验所确定方法与NY/T 1800-2009方法比较

称取2份5 g蒜泥，按NY/T 1800-2009处理[11]，用FID上机检测，比较2种前处理方法的大蒜素提取率，见表2。

表2 2种前处理方法的大蒜素提取率Table 2 The yeild of allicin with two pretreatment methods

通过对比实验结果(见表2)，优化条件下的大蒜素提取率比NY/T 1800-2009标准方法的提取率增加42.4%，且优化方法的操作简单，可以作为日常检测大蒜及大蒜制品中大蒜素含量的方法。由于影响大蒜素提取率的因素较多，在设计实验中可能存在不足，需进一步论证。