卢冬梅,曾靖雅,潘进权,蔺红苹,蒋 边

(岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江 524048)

火龙果(Hylocereusundatus)为仙人掌科(Cactaceae)植物,别名有仙蜜果、情人果、红龙果等[1-2]。因火龙果果实呈橄榄状果形,外表又有像蛟龙外麟的肉质鳞片,所以得名火龙果[3-4]。火龙果可分为3类,分别是红色皮红色肉、红色皮白色肉、黄色皮白色肉[5]。火龙果营养丰富、功能独特,含有一般植物少有的植物性白蛋白以及花青素,丰富的维生素和水溶性膳食纤维[6-7]。经常食用火龙果有助提高人体免疫力,不仅有降血压、抗氧化、抗癌和预防心血管疾病等作用,还具有养肤减重、明目、护胃等作用[8-9]。

关于火龙果的研究,主要集中在火龙果不同部位营养成分的测定和评价[10-11],以及果皮天然食用色素[12]、果胶[13]、种子油[14]和黄酮化合物[15]的提取开发等,并且采用超声波提取法[16]、微波辅助提取法[13]和亚临界水提取法[17]等方法提取活性物质,但是火龙果发酵方面国内外研究少见报道。由于火龙果富含营养物质,经过微生物发酵后富含各种酶和酶促产物及各种营养物质,含有火龙果本身以及酵母菌发酵产生的双重营养价值,具有很好的营养保健功能。目前火龙果发酵大部分研究是酵素产品研发[18]、果酒[19-23]、复合果酒[24-25]、复合米酒[26]、果醋[27]、低糖果脯[28]和凝固型酸奶[29]等食品发酵工艺研究,采用的主要菌种为酵母菌,但是火龙果发酵代谢产生的生物活性成分及其抗氧化活性研究比较少。董银卯等[18]进行火龙果果实经酵母菌发酵后的产物初步研究;乌日娜等[20]研究4种不同酵母发酵的火龙果酒在发酵过程中总酚、甜菜苷、抗氧化活性和颜色的变化规律;袁星星等[23]研究了红肉火龙果果酒发酵期间品质变化。但少有酵母菌发酵不同种类和部位火龙果的抗氧化活性及其相关性的研究。

本文分析酵母菌发酵不同种类和部位火龙果的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性(总抗氧化能力、还原能力和羟自由基清除能力)的影响及讨论酚类、黄酮类物质与抗氧化活性的相关性,为火龙果的综合利用以及深加工提供理论依据。特别火龙果皮都作为废弃物丢弃,造成了极大的浪费,变废为宝,具有一定社会价值和实用意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜火龙果 广东省湛江市市场;白砂糖 市售,为食用级;安琪葡萄酒高活性干酵母RV171 购自安琪酵母股份公司;没食子酸(gallate acid,GA) 广东翁江化学试剂有限公司,99%;芦丁 美国sigma公司,98%;维生素C(VC) 广东西陇化工有限公司,98%;邻二氮菲和铁氰化钾等其他试剂 均为国产分析纯。

LG16-W型离心机 北京京立离心机有限公司;UV-3000PC型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;VIS-722(N.S)型可见光分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;DZKW-C型仪表恒温不锈钢水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司;YXQ.SG41.280电热手提压力蒸汽消毒器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 选择成熟度高、无霉烂变质及无病虫害的新鲜火龙果,洗净晾干后把表面的鳞片剪去。将不同种类的火龙果的不同部位(红心火龙果果肉,red flesh,RF;白心火龙果果肉,white flesh,WF;红心火龙果果皮,red peel,RP;白心火龙果果皮,white peel,WP)分离并切粒、打浆;通过添加25%白砂糖,10%酵母菌RV171,采用前期预实验温度为30 ℃下发酵4 h;发酵完成后用6层细纱布进行过滤,将过滤所得的滤汁经离心机10000 r/min离心10 min,制成火龙果不同种类和部位的发酵液,用于体外抗氧化活性测定。

1.2.2 总酚(total phenolic contents,TPC)含量的测定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法来测定火龙果发酵液的TPC含量[30]。1 mL样品与1 mL福林酚试剂混匀,5 min后加3 mL质量分数20% Na2CO3溶液和5.0 mL蒸馏水充分混匀,并避光反应1.5 h,于波长765 nm处测吸光度。以GA为标准品(200～1200 mg/L)绘制标准曲线,回归方程为y=0.0083x+0.0594,相关系数为R2=0.9935。总酚含量(mg/L)=(OD765-0.0594)×稀释倍数/0.0083。

1.2.3 总黄酮(total flavonoid contents,TFC)含量的测定 采用Al(NO3)3-NaOH-NaNO2法测定样品中TFC的含量[31]。0.4 mL样品与0.3 mL质量分数5% NaNO2溶液室温反应6 min后,加入0.3 mL质量分数10% Al(NO3)3溶液混匀后反应6 min,加入4.0 mL质量分数4% NaOH溶液和5.0 mL蒸馏水充分混匀,反应15 min后,于波长510 nm处测吸光度。以芦丁为标准品(100～500 mg/L)绘制标准曲线,回归方程为y=0.0015x-0.0013,相关系数为R2=0.9979。总黄酮含量(mg/L)=(OD510+0.0013)×稀释倍数/0.0015。

1.2.4 体外抗氧化活性的测定

1.2.4.1 总抗氧化能力的测定 采用磷钼络合法[32]测定样品的总抗氧化能力。试管中依次加入3 mol/L H2SO4溶液2 mL、0.14 mol/L Na3PO4溶液2 mL和0.02 mol/L钼酸铵溶液2 mL。再加入2 mL样品,用蒸馏水定容至10 mL,混合均匀。加塞于95 ℃水浴中加热90 min,取出冷却后用空白(蒸馏水代替样品)调零在695 nm波长下测量。VC作为标准品,以吸光度(A695)为纵坐标,VC的浓度(40～120 mg/L)为横坐标绘制标准曲线,回归方程为y=0.0079x-0.1493,相关系数为R2=0.9941。总抗氧化能力以等量VC(mg/L)表示。总抗氧化能力(等量VC浓度mg/L)=(OD695+0.1493)×稀释倍数/0.0079。

制备不同浓度的样品,测定其总黄酮质量浓度和总抗氧化能力,研究不同总黄酮质量浓度对总抗氧化能力的影响。

1.2.4.2 还原能力的测定 采用普鲁士蓝法[33]测定样品的还原能力。取2.5 mL不同浓度的样品,加入0.2 mol/mL磷酸盐缓冲液(pH6.6)2.5 mL和1% 铁氰化钾2.5 mL,混合均匀,于50 ℃恒温水浴中反应20 min后急速冷却;取出再加入10% 三氯乙酸2.5 mL。而后于3000 r/min下离心10 min,取上清液2.5 mL加入蒸馏水2.5 mL,加1 mg/L三氯化铁0.5 mL,混匀后用分光光度计于700 nm波长处测定吸光值。以VC为标准品,绘制标准曲线。还原能力以等量VC(mg/L)表示。

取不同浓度的样品,测定其总黄酮质量浓度和还原能力,研究不同总黄酮质量浓度对还原能力的影响。

1.2.4.3 羟基自由基清除能力的测定 参照Fenton方法[34]的方法测定样品对羟基自由基的清除能力。精密量取2.0 mL磷酸盐缓冲液(PBS,0.4 mol/L,pH=7.4),4.0 mL蒸馏水于试管中,作为空白参比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)和2.0 mL蒸馏水,作为未损伤管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL蒸馏水,作为损伤管;精密量取2.0 mL PBS、3.0 mL蒸馏水和1.0 mL样品作为样品参比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL样品作为样品管。

将上述各管置恒温水浴锅中,37 ℃保温60 min,在536 nm处测定吸光值。按下式计算清除率:

羟自由基清除率(%)=[(Α样品-Α样参)-(Α损伤-Α空参)]/(Α未损-Α损伤)×100

式中:A样品为样品管的吸光度;A样参为样品参比管的吸光度;A空参为空白参比管的吸光度;A未损为未损伤管的吸光度;A损伤为损伤管的吸光度。

取不同浓度的样品,测定其总黄酮质量浓度和羟基自由基清除能力,研究不同总黄酮质量浓度对羟基自由基清除能力的影响。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 总酚和总黄酮含量分析

如图1所示,不同种类和部位火龙果发酵液总黄酮含量的变化范围为386.64～452.42 mg/L,和白心火龙果相比,红心火龙果具有较高的总黄酮含量,分别RP为452.42 mg/L和RF为418.87 mg/L;果皮总黄酮含量大于果肉。不同种类和部位火龙果发酵液总酚含量的变化趋势为RP>WP>RF>WF,与WF相比，具有显著性差异,RP发酵液中的总酚含量最高,为636.63 mg/L。与其他发酵产品相比[35],自然发酵的葡萄、桃和苹果中,总黄酮含量分别为478.10、188.19和147.60 mg/L,总酚含量分别为710.47、323.50和217.57 mg/L。火龙果发酵后的总黄酮和总酚含量低于葡萄,明显高于桃和苹果。

图1 不同种类和部位火龙果发酵液中总酚和总黄酮含量

乌日娜等[20]研究发现,酵母 RC212发酵的火龙果酒的多酚含量最高为272.5 mg/L,远远低于本文火龙果发酵液中的多酚含量,这可能是由于发酵条件的不同、火龙果的品种和种植环境等一系列条件的不同造成的。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 总抗氧化能力 如图2所示,火龙果发酵液具有较强的总抗氧化能力,且不同种类和部位发酵液对总抗氧化能力不同。和白心火龙果相比,相同部位红心火龙果具有较高的总抗氧化能力,其中RP发酵液总抗氧化能力最强,总黄酮含量为113.00 mg/L时,等量VC浓度169.32 mg/L,但是白心火龙果果皮总抗氧化能力强于红心火龙果果肉,WP发酵液的总黄酮含量为97.00 mg/L时,等量VC浓度135.90 mg/L;果皮总抗氧化能力强于果肉。沈佩仪[33]研究发现,菠萝皮1 g提取物相当于0.037 g VC,小于火龙果发酵液的总抗氧化能力,说明在抗氧化活性物质方面,火龙果要优于菠萝。

图2 不同总黄酮质量浓度的总抗氧化能力

2.2.2 还原能力 如图3所示,不同种类和部位火龙果发酵液的还原能力具有极显著性差异(p<0.01)。和白心火龙果相比,相同部位红心火龙果具有较高的还原能力,其中RP发酵液还原能力最强,总黄酮含量为113.00 mg/L时,还原能力为等量VC浓度140.29 mg/L,但是白心火龙果果皮还原能力强于红心火龙果果肉,WP发酵液的总黄酮含量为97.00 mg/L时,还原能力为等量VC浓度122.02 mg/L;果皮还原能力强于果肉。乌日娜等[20]研究发现,酵母R2发酵的火龙果酒的总还原力 IC50为28.52%,远小于RP发酵液。可能与火龙果本身所含黄酮类、酚类物质,及发酵液中酵母菌及其代谢产物相关。

图3 不同总黄酮质量浓度的还原能力

2.2.3 羟自由基清除能力 在氧自由基中,羟基自由基的毒性最大。医学研究表明,羟基自由基性质十分活跃且对机体生物膜有极强的破坏力。受外界环境中诸多不良因子的影响,生物体内往往会产生过量的羟自由基,导致机体发生病理变化,从而引发多种疾病。如图4所示,和白心火龙果相比,相同部位红心火龙果具有较高的还原能力,其中RP发酵液和WP发酵液对羟自由基清除能力无显著性差异(p>0.05),RP发酵液总黄酮含量为90.40 mg/L时清除率为96.65%,WP发酵液总黄酮含量为97.00 mg/L时清除率为95.87%;果皮羟基自由基能力清除强于果肉,RF和WF发酵液对羟自由基清除能力分别为88.98%和86.29%,与WF相比具有显著性差异(p<0.05)。马若影等[17]亚临界水提取红心火龙果茎多糖,其羟自由基清除率可达95.15%,从比较结果可以看出亚临界水提取和酵母菌发酵效果相当,RP发酵液具有相当强的羟自由基清除率。

图4 不同总黄酮质量浓度对羟自由基的清除作用

董银卯等[18]进行火龙果果实酵母菌发酵后,当浓度在50%时,清除率为47.5%;乌日娜等[20]研究发现,酵母R2发酵的火龙果酒的羟自由基清除率IC50为 8.84%,远小于RP发酵液。

表1结果表明,RP发酵液具有较高的羟自由基清除能力,说明经酵母菌发酵可提高火龙果对羟自由基的清除作用,可能与火龙果发酵液中多酚类物质,及酵母菌的抗氧化成分和氧化还原调控系统等有关[36]。

表1 发酵前后多酚、总黄酮含量及抗氧化活性测定(以RP发酵液为例)

2.2.4 不同火龙果发酵液的体外抗氧化活性相关性分析 越来越多的研究显示抗氧化的重要性,植物抗氧化活性已成为研究热点。如图2～图4所示,在一定范围内,随着不同火龙果发酵液的增加,体外抗氧化活性也增加。进一步相关性分析见表2,RF发酵液与总抗氧化能力和还原能力之间呈显著正相关,与羟自由基清除能力呈不显著正相关;WF、RP和WP发酵液与还原能力之间呈极显著正相关;RP和WP发酵液与总抗氧化能力之间呈极显著正相关,与羟自由基清除能力之间呈显著正相关;WF发酵液与羟自由基清除能力之间呈极显著正相关,与总抗氧化能力之间呈显著正相关。

表2 不同火龙果发酵液的体外抗氧化活性相关性分析

2.3 总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

目前很多研究表明,植物活性成分的含量、比例与抗氧化性之间存在良好的相关性。如表3所示,多酚含量与还原能力之间呈显著正相关(r=0.967),与羟自由基清除能力呈极显著正相关(r=0.967),与总抗氧化能力呈不显著正相关,总黄酮含量与总抗氧化能力、还原能力和羟自由基清除能力呈不显著正相关。相关性分析显示,酚类物质是火龙果发酵液中主要的抗氧化成分,但黄酮不是火龙果发酵液中主要的抗氧化成分,可能是其他酚类物质如甜菜苷、鞣质等。

表3 总黄酮、总酚含量与体外抗氧化活性相关性分析

3 结论

不同种类和部位火龙果发酵液中,总黄酮含量、总酚含量和抗氧化活性不同,但都表现出浓度依赖性,随着样品浓度的增加而升高。其中不同发酵液中总黄酮含量变化范围为386.64～452.42 mg/L;总酚含量为534.08～636.63 mg/L;总抗氧化能力、还原能力和羟自由基清除能力分别为104.47～169.32、67.97～140.29 mg/L和86.29%～96.65%。从火龙果不同种类发酵液来看,总黄酮含量无显著性差异;总酚含量,红心火龙果肉>白心火龙果肉(p<0.05);抗氧化活性,红心火龙果>白心火龙果。从火龙果不同部位发酵液来看,总黄酮含量无显著性差异;总酚含量:果皮>果肉;抗氧化活性:果皮>果肉。RP和WP发酵液总抗氧化能力具有极显著性差异(p<0.01);RP、WP、RF和WF发酵液的还原能力具有极显著性差异(p<0.01);RF和WF发酵液对羟自由基清除能力具有显著性差异(p<0.05)。

综上所述,红心火龙果RP发酵液的总黄酮和总酚含量最高,总抗氧化能力、还原能力和羟自由基清除能力最强。相关性分析显示,多酚类物质是火龙果中主要的抗氧化成分,黄酮不是火龙果发酵液中主要的抗氧化成分,但具体的火龙果发酵液中酚类物质组成和含量及其与抗氧化能力间的关系仍待进一步的研究。

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