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钙网蛋白在人喉癌细胞中的表达及临床意义

2018-02-22高树峰张克辉游龙贵刘遗斌罗冬黄振河王心涛

中国当代医药 2018年34期
关键词:临床意义

高树峰 张克辉 游龙贵 刘遗斌 罗冬 黄振河 王心涛

[摘要]目的 探讨钙网蛋白(CRT)在人喉癌细胞中的表达及临床意义。方法 应用荧光定量PCR(RT-PCR)、蛋白印记(Western blot)检测CRT在mRNA与蛋白水平上的差异性变化。结果 喉癌组织CRT的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),CRT mRNA表达升高67%,CRT蛋白表达升高71%。结论 CRT可能参与了喉癌的发生、发展过程,CRT可能是喉癌一个潜在的基因治疗靶点。

[关键词]钙网蛋白;喉癌细胞;临床意义

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2018)12(a)-0026-04

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,以40~60岁男性多见,近年来发病率有明显增高的趋势,其肿瘤的发生、发展是一个渐进过程,具体的疾病发生机制尚未完全知悉,多数研究显示肿瘤细胞的凋亡受阻可能与其疾病的发生、发展有相关性。钙网蛋白(calreticulin,CRT)为细胞表面的一种重要标志物,研究显示,其在许多恶性肿瘤中均有表达状态,且在调控肿瘤细胞的发生、发展中发挥重要作用[1-2]。本研究应用荧光定量PCR(RT-PCR)、蛋白印记(Western blot)检测CRT在mRNA与蛋白水平上的差异性变化,探讨CRT基因在人喉癌细胞中的表达及临床意义,旨在为喉癌的基因治疗提供有效的备选靶标之一,现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及主要试剂 从喉癌组织悬液提取的人喉癌上皮细胞;胎牛血清(NycoPrep公司);HRP标记的优质内参(上海康成生物);CRT抗体abcam;RIPA裂解液[碧云天(北京)];Goat Anti-Rabbit IgG[Southern Biotechnology,Inc(USA)];SDS-PAGE试剂[Abcam,Inc(UK)];Peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG[博士德生物(武汉)];定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen)。

1.1.2主要仪器 流式细胞仪[BD Inc(USA)];定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix[Invitrogen Inc(USA)];倒置荧光显微镜[Leica Inc(Germany)];细胞恒温培养箱[Thermo Fisher Scientific Inc(USA)]。

1.2主要实验方法

1.2.1单细胞悬液制备 取少量喉癌组织约0.5 g置于匀浆器中,清洗后仔细剔除脂肪、坏死组织、纤维及结缔组织;用干净的组织剪将组织充分剪小、剪碎并不断轻微揉搓,置120目不锈钢网上,然后边轻搓边用纯净水不断冲洗,静置待自然沉淀后收集喉癌组织细胞混悬液;将混悬液用300目尼龙细网再次过滤,静置后收集细胞悬液。将此悬液置于离心机1200 r/min,离心2~5 min,弃上清液后再次1200 r/min离心2 min,弃上清液后加入1 ml PBS将细胞悬浮,记数并调整细胞浓度为1×106/ml。

1.2.2 RT-PCR 按照TRIzol的操作说明对组织蛋白进行RNA提取,用紫外分光光度仪进行总RNA定量后,按逆转录酶反转录体系推荐的2 μg RNA反转录,并用于做q-PCR。使用Primer Premier 5软件设计引物,β-actin为内参照;β-actin-F:5′-TGCATGAGGATGCAGCAGTT-3′,β-actin-R:5′-TCCGCGACAATGTGATCTTA-3′;扩增片段大小:β-actin为235 bp;CRT-F:5′-CTAGATGAGTTGAAGCAGTG-3′,CRT-R:5′-CGGGATCTAATATGTGTCTC-3′;目的片段:CRT为225 bp。以(Oligo)dT作为引物据序列互补原则,利用逆转录酶逆转录合成cRNA第一链后,取5 μl cRNA为模板再进行PCR扩增;PCR管中依次加入第一链cRNA、上游下游引物各5 μl、2xSYBR Green qPCR SuperMix 10 μl、Dntp5 10μl、Taq酶(2 U/10 μl)210 μl,适量ddH2O加至共体积20 μl,轻轻混合均匀离心,设定参数后在实时荧光定量PCR仪上扩增,行琼脂糖凝胶电泳后查看试验结果。设置以喉癌组织标本细胞作为试验的实验HEP2-A组,与来自未经任何处理的正常机体细胞作为试验的对照HEP2-B组。反应条件:50℃ 2 min,95℃ 2 min,95℃ 15 s,60℃ 32 s读板,40 cycles。

1.2.3 Western blotting 根据制备的细胞悬液喉癌细胞量加入相应RIPA裂解液,匀浆置冰,裂解30 min后(过程中要经常指弹便于充分裂解)常规提取细胞蛋白行蛋白的初步定量分析;取样品50 μg,与上样缓冲液按2∶1混合,沸水浴5 min充分混合均匀;配制4%的浓缩胶,经SDS-PAGE电泳(80 V恒壓50 min,或60 V转移2 h,或40 V转移3 h,转完出现溴酚蓝刚出胶底部止)、转膜至常规PVDF膜,5%的脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h,一抗4℃过夜、二抗37℃孵育1 h,TBST液洗涤5 min×3次,加入Immobilon Western Chemilum HRP Substrate,杂交膜表面上反应5 min,去尽残夜,滤纸吸净多余底物溶液,备好1×显影液和定影液,于暗室中曝光、显影、定影。同时设置以β-actin为内参照,同样以喉癌组织标本细胞作为试验的实验组,而来自未经任何处理的正常机体细胞作为对照组;应用凝胶图像处理分析系统软件进行图像扫描分析。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,组内两两数据比较采用t检验或单向方差分析,多组间数据比较采用F检验,以P<0.05为差异有统计意义。

2结果

2.1 RT-PCR

试验样品经琼脂糖凝胶电泳,通过分析5、15、20 s rRNA 3条带谱,其完整性系数提示纯度检测无蛋白污染;完整性检测Total RNA抽提完整(图1)。结果显示,CRT mRNA于喉癌细胞mRNA表达有明显升高,实验HEP2-A组的表达阳性率升高67%,高于设置的对照HEP2-B组(t=3.20,P<0.05),CRT-mRNA表达差异有统计学意义(F=31.17,P<0.05)(表1)。

2.2 Western blotting

分别将对照组、实验组提取细胞蛋白并检测细胞CRT蛋白表达水平,结果显示,与对照组比较,实验组目的基因在喉癌细胞中有显著的蛋白表达提升,经过对其灰度分析后显示目的蛋白在喉癌细胞中较对照组提升71%CRT的表达;而非靶向蛋白β-actin的表达无影响;分析CRT蛋白表达率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

3讨论

CRT最初被认为是内质网(endoplasmic reticulum,ER)上的钙离子结合蛋白,其进化过程中具有高度保守性,最初是從兔骨骼肌的内质网分离提取而来;近年研究发现其在细胞外也有表达,其蛋白由单基因编码,具有多种生物学功能,包括蛋白加工、细胞内钙离子的调节、抑制瘤体血管增生和参与抗原递呈及肿瘤瘤体细胞凋亡等各项功能。另外,CRT在肿瘤胞膜稳定完整的表达可促进某些肿瘤的免疫原性凋亡,使肿瘤细胞对凋亡信号刺激的感受性增强[3]。在肿瘤的实际治疗过程中,免疫治疗与化疗往往很难很好地结合在一起,患者经过几个疗程的化疗之后,体内大量的免疫效应器被破坏,所以针对肿瘤的抗原免疫反应在体内很难产生。研究发现CRT过度表达的肿瘤细胞对放、化疗而诱发的胞体凋亡更显敏感,在细胞表面被作为凋亡细胞的标志,可以作为信号刺激因子被吞噬细胞识别和吞噬,从而引起肿瘤细胞的免疫原性凋亡;还可通过阻止Akt信号转导、改变Ca2+稳态来调节P53功能,以调整其诱发细胞凋亡[4]。此外,凋亡肿瘤细胞表面的CRT还可能被抗原呈递细胞-树突状细胞识别,从而促进清除凋亡细胞,参与抗原提呈和活化特异性的免疫应答反应[5]。近年来的研究显示,CRT从细胞的ER移位到胞膜是凋亡细胞免疫原性的重要标志,这种生物学上的转移决定特异性抗肿瘤免疫应答的产生,利于肿瘤的优化性治疗,提示CRT与E6或E7联合的疫苗均使置瘤的荷瘤实验小鼠产生了抗E6或E7的显著T细胞特异性免疫应答[6-8]。CRT的表达促进肿瘤细胞的主动性免疫原性死亡,有利于清除残瘤肿瘤细胞,这为以后的抗肿瘤治疗提供了一种可能有效的免疫治疗新靶点。在临床肿瘤诊断方面,多种肿瘤细胞表面CRT及其裂解片段较正常组织有差异性表达量的改变,这为肿瘤的诊断提供了有利的帮助,这种发生、发展及预后密切相关性[9-10],提示其可能成为新肿瘤标志物的潜在价值备选因子之一,以后有望在肿瘤的早期诊断及疾病预后判断发挥作用。在膀胱癌的研究中,通过检测尿中CRT发现其表达量也明显增加,考虑是否将CRT作为潜在生物学标志应用于早期诊断[9]。另外,在结肠癌、宫颈癌、神经母细胞瘤中,尤其在高度恶性和低分化区域,CRT的高表达直接关系到肿瘤的进展,提示CRT与肿瘤细胞的生长、分化、转移和预后有直接的关系[10-11]。另用含有特异性CRT融合基因载体和含CRT的基因疫苗免疫实验小鼠,结果观察到荷瘤小鼠的抗瘤效应非常明显,并且多次试验后发现其诱导并强化了荷瘤小鼠的免疫记忆细胞,这为将来的肿瘤治疗性疫苗的开发研究迈出了不可或缺的关键一步[12-17]。

本研究中,为了进一步明确CRT在喉鳞状细胞癌中作用,笔者将喉癌组织通过荧光定量PCR、Western blot,检测CRT在mRNA与蛋白水平上的差异性变化。结果显示,喉癌组织CRT的mRNA和蛋白表达水平显著升高,初步提示CRT可能参与了喉癌的发生、发展过程,其表达上调在喉癌进展中发挥了重要的作用。

综上所述,CRT可能是喉鳞状细胞癌一个潜在的基因治疗靶点。但是,因肿瘤的发生及发展的多因素复杂性,可能涉及相关多基因[18],CRT单独或联合其他基因的综合治疗性实验研究还有待进一步证实;CRT能否真正成为喉癌临床治疗的有效靶点,还需进一步的深入研究。

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(收稿日期:2018-09-04 本文编辑:祁海文)

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