李祥明，李会荣

（山东省饲料质量检验所，山东济南 250022）

饲料中炔雌醚的液相色谱检测方法研究

李祥明，李会荣

（山东省饲料质量检验所，山东济南 250022）

本研究建立了饲料中炔雌醚含量的液相色谱检测方法。饲料样品用乙腈提取，经离心和C18SPE小柱净化，以C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）为分离柱，紫外检测器在230 nm波长下进行检测，外标法定量。结果表明：在所选择的色谱条件下，炔雌醚在0.50～100.00 μg/mL时线性关系良好，最低定量限为1 mg/kg；添加回收率为89.5%～99.5%，变异系数为0.5%～5.20%。本方法样品前处理简便、可靠，可用于各种饲料中炔雌醚的检测。

饲料；炔雌醚；测定；液相色谱法

炔雌醚又名炔诺醚，炔雌醇环戊醚，3-环戊醚，17а-乙炔基雌烷二醇等，为白色的结晶或结晶性粉末。可在乙醇、丙酮、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中几乎不溶（中华人民共和国国家药典委员会，2005）。

炔雌醚在临床上作为较强的口服长效雌激素，其活性为炔雌醇的4倍，口服后经胃肠道吸收，贮存于脂肪组织内，缓慢释放出炔雌醇，起主要的抗生育作用。农业部第176号公告明确规定，禁止在动物饲料和饮水中添加炔雌醚。目前鲜见饲料中炔雌醚检测方法的研究报道。因此，本研究建立的炔雌醚检测方法，可加强监管部门对饲料中炔雌醚的监督检测和风险预警。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 分析纯乙腈、甲醇，色谱纯乙腈。

1.1.2 仪器和设备 分析天平（感量0.1 mg）；Agilent 1200液相色谱仪 （具有VWD检测器）；离心机（Theremo G16）；氮吹仪；Agilent固相萃取装置。

1.1.3 标准物质 炔雌醚标准品纯度大于98%。1.1.3.1 炔雌醚标准储备溶液 精密称取炔雌醚标准品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈定容，配成浓度为10 mg/mL的标准贮备溶液。2～8℃冷藏保存，有效期为6个月。

1.1.3.2 炔雌醚标准中间溶液 准确移取炔雌醚标准储备溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用色谱纯乙腈定容至刻度。该溶液中炔雌醚的浓度为1 mg/mL。2～8℃冷藏保存，有效期为3个月。

1.1.3.3 炔雌醚标准工作溶液 准确移取炔雌醚标准中间溶液适量，用色谱纯乙腈稀释成浓度分别为 0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和100.00 μg/mL的标准工作溶液。现用现配。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱条件的确定 目前国内外有关炔雌醚的研究主要在医药和化妆品检测领域，检测方法包括紫外分光光度法 （中华人民共和国国家药典委员会，2005）、液相色谱法（刘红菊等，2010；Tao等，2010）、液相色谱-串联质谱法（黑龙江省质量技术监督局，2011）和气相色谱质谱法（林奕芝等，2009；林奕芝等，2006），本研究在参照液相色谱检测方法的基础上，对色谱条件进行了优化和改进，最终确定的条件为：色谱柱：C18柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm，或其他效果等同的C18柱。柱温：40℃。波长：230 nm。流动相：色谱纯乙腈+水=80+20。 流速：1.0 mL/min。 进样量：50 μL。

实验结果见图1。结果表明，该色谱条件均能满足色谱分析的需要。

图1 炔雌醚标准工作溶液图谱

1.2.2 试样提取条件的确定 由于炔雌醚易在乙醇、丙酮、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中几乎不溶的性质，提取液只能在有机溶剂中选择，考虑到实验室常用的试剂和每类试剂毒性的大小，选择了甲醇和乙腈作为提取试剂进行了比较。实验结果表明，相同的饲料样品，甲醇作为提取液时，试样中提取出的杂质种类多且含量高，其回收率和乙腈基本相似。因此，选择乙腈为提取液。甲醇和乙腈提取相同饲料样品的图谱见图2和图3。

图2 甲醇提取的饲料样品图谱

用乙腈为提取液，分别用振荡和超声提取10、15、20 min 和 30 min。 实验结果表明，用振荡器振荡比超声波提取的回收率略高。振荡20 min和30 min回收率基本相同，为了节约时间，选用振荡20 min。最终确定的提取步骤为：称取试样5 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加入15.0 mL乙腈，充分振荡20 min，然后静置沉淀5 min，取4.0 mL上清液于20 mL试管中，加入12 mL水混匀，备用。

图3 乙腈提取的饲料样品图谱

1.2.3 SPE净化条件的确定 根据炔雌醚的理化性质和极性，首先选择了C18小柱进行回收实验，选用不同的上样溶剂、淋洗溶液和洗脱溶液，结果见表1。

表1 不同净化条件结果比较

实验结果表明，只有上样溶剂中乙腈的比例小于30%时，炔雌醚才能完全吸附于填料上；淋洗溶液中乙腈的比例小于30%时，炔雌醚不会被洗脱下来。因此，吸取4.0 mL乙腈提取液中需加入12 mL水，使乙腈的比例为25%，上样溶液中的炔雌醚才能充分吸附于填料上。当溶液中乙腈的比例为10%时，回收率和乙腈比例为25%的基本相同，考虑到过SPE小柱更节约时间的情况下，选择乙腈的比例为25%，即吸取4.0 mL乙腈提取液中加入12 mL水。淋洗溶液选用1+3的乙腈水溶液，保证了淋洗时目标物不会被洗脱。淋洗液中乙腈比例低于25%时，洗脱杂质的效果降低。洗脱溶液中乙腈和甲醇的回收率相同，为了和流动相一致，故选用乙腈为洗脱液。最终确定的净化条件为：固相萃取C18小柱用3 mL甲醇、3 mL水活化。将提取溶液过柱（流速＜1 mL/min），用3 mL乙腈溶液（1+3）淋洗，用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，氮吹仪上（50℃）至干，用1.00 mL乙腈溶解，过0.22 μm滤膜后上机测定。

2 结果

2.1 标准工作溶液线性 将浓度分别为0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和 100.00 μg/mL的标准工作溶液，每个浓度连续进样3次，按平均值计算标准曲线线性。线性范围为0.50～100.00 μg/mL，获得标准曲线y炔雌醚=62.7x+8.9648，线性相关系数R2=1.000。结果见图4。

图4 炔雌醚标准曲线线性

2.2 方法线性实验 用蛋鸡配合饲料分别做1、5、10、20 mg/kg和50 mg/kg的添加实验，其添加浓度和峰面积的线性见图5。线性相关系数R2=0.9992。

图5 炔雌醚方法线性

2.3 方法检出限和定量限实验 在空白的蛋鸡配合饲料、肉牛精料补充料、猪浓缩饲料和猪预混合饲料中添加不同浓度的炔雌醚。添加回收实验表明，在添加浓度为0.50 mg/kg时，由于前处理过程要稀释，即上机试液中炔雌醚的浓度大约为0.60 μg/mL，而配合饲料由于提取出的其他干扰物质含量较高，致使信噪比 S/N（Peak to Peak）＜10，炔雌醚的回收率均低于70%。因此本方法的检出限定为0.5 mk/kg，定量限定为1 mg/kg。0.5 μg/mL炔雌醚标样的图谱见图6；蛋鸡配合饲料空白和添加图谱见图7和图8；肉牛精料补充料的空白和添加图谱见图9和图10；猪浓缩饲料的空白和添加图谱见图11和图12；猪预混合饲料空白和添加图谱见图13和图14。

图6 0.5 μg/mL炔雌醚标样

图7 空白蛋鸡配合饲料图谱

图8 蛋鸡配合饲料1mg/kg炔雌醚添加图谱

图9 空白肉牛精料补充料图谱

图10 肉牛精料补充料1 mg/kg炔雌醚添加图谱

图11 空白猪浓缩饲料图谱

图12 猪浓缩饲料1 mg/kg炔雌醚添加图谱

表2 不同饲料中添加炔雌醚回收率%

图13 空白猪预混合饲料图谱

图14 猪预混合饲料1 mg/kg炔雌醚添加图谱

2.4 方法准确度和精密度实验 选择空白对虾配合饲料、蛋鸡配合饲料、肉牛精料补充料、猪浓缩饲料和育肥猪预混合饲料进行加标回收率实验。在上述饲料中分别加入适宜体积的炔雌醚标准工作溶液，使其添加浓度均为1、5、10 mg/kg和50 mg/kg，进行加标回收实验。结果见表2。实验结果表明，该方法添加回收率为89.5%～99.5%，变异系数为0.5%～5.20%。方法适用的范围为畜禽、水产配合饲料、精料补充料、浓缩饲料和预混合饲料。

3 结论

本研究建立的饲料中炔雌醚液相色谱检测方法，样品的提取和净化步骤科学合理，易于掌握，测试数据重复性好，添加回收率均可满足分析实验要求，可很好的满足饲料中炔雌醚的测定要求。

[1]黑龙江省质量技术监督局.饲料中炔雌醚的测定，液相色谱-质谱/质谱法[S].DB23/T 1435-2011.

[2]刘红菊，闫冲，刘宏果.反相高效液相色谱法同时测定饲料中的10种性激素[J].中国饲料，2010，18：34 ～ 36.

[3]林奕芝，司徒潮满，刘奋，等.深圳市市售肥牛、羊肉中雌激素残留状况分析[J].现代预防医学，2009，36（6）：1168 ～ 1169.

[4]林奕芝，张世英，梁伟，等.深圳市肉与肉制品中激素残留状况分析[J].中国卫生检疫杂志，2006，13（3）：271 ～ 272.

[5]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].北京：化学工业出版社，2005.360.

[6]Tao Tang，Pingliang Li，laixin Luo.Development and validation of a HPLC method for determination of levonorgestrel and quinestrol in rat plasma[J].Chromatography，2010，24：706 ～ 710.■

The study established a liquid phase chromatographic method for determination of quinestrol in feed.Feed samples were firstly extracted by acetonitrile，then purification with C18SPE column，after being isolated by C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）column，eventually detected by UV detector at 230 nm，and were quantified by external standard method.The results showed that under the selected chromatographic conditions，quinestrol was linear in the range of 0.50 ～ 100.00 μg/mL，and the lowest determination limit was 1 mg/kg.The relative standard deviation （RSD）was 0.5% ～5.20%when the recovery rate was 89.5% ～ 99.5%.The method was proved to be simple，rapid and resproducible for determination of quinestrol in feed.

feed；quinestrol；determination；liquid phase chromatographic method

S816.17

A

1004-3314（2017）20-0028-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172007