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(1.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;2.中国科学院大学,北京 100049;3.上海科技大学,上海 201210;4.上海大学,上海 200444)

N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建

李思杰1,2,3,纪明华1,赵利超1,4,史吉平1,3,孙俊松1,3,*

(1.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;2.中国科学院大学,北京 100049;3.上海科技大学,上海 201210;4.上海大学,上海 200444)

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的Pholin启动子并构建了pMK4-Pholin-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对Pholin及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的Pholin用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒pMK4-Pholin-neuBC。研究结果显示:Pholin启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,Pholin的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。

启动子,N-乙酰神经氨酸,枯草芽孢杆菌

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)能促进大脑发育,具有改善人体记忆力、抗病毒等功效,在食品保健品和医药领域均有重要的用途[1]。但是,N-乙酰神经氨酸单体的制备成本较高,因此近年来多种微生物被用于N-乙酰神经氨酸的外源生产,如大肠杆菌通过外源表达UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因(neuC)和N-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB),并通过敲除相关的基因已经可以高产Neu5Ac[2],但大肠杆菌作为革兰氏阴性菌,在发酵过程中会积累大量的内毒素[3]。……