穆晓婷，钱 平，蒋璐璐，王 玥，靳 鑫，张东方

路路通酸对乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌C-33A细胞增殖的影响

穆晓婷，钱 平，蒋璐璐，王 玥，靳 鑫，张东方*

目的 研究路路通酸(BTA)对乳腺癌MCF-7细胞及宫颈癌C-33A细胞增殖的影响。方法 采用MTT法检测不同浓度BTA作用不同时间后对MCF-7细胞、C-33A细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测BTA处理后细胞周期的变化。结果 BTA作用于乳腺癌MCF-7细胞24、48、72 h后的IC50分别为(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用于宫颈癌C-33A细胞24、48、72 h后的IC50分别为(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，BTA对2种细胞增殖有明显抑制作用，且呈浓度时间依赖性(P<0.05)，流式结果显示，BTA将MCF-7细胞阻滞在S期，并诱导其凋亡；BTA将C-33A细胞阻滞在G1-S期。结论 BTA对乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌C-33A细胞具有较强的增殖抑制作用，其机制与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关。

路路通酸；乳腺癌；宫颈癌；增殖抑制

0 引言

路路通为金缕梅科植物枫香树(LiquidambarformosanaHance)的干燥成熟果实，是临床常用中药，具有祛风活络、利水、通经的功效，用于治疗关节痹痛、麻木拘挛、水肿胀满、乳少经闭等证[1]。现代临床研究表明，路路通用于治疗乳腺炎、卵巢囊肿、痛经、闭经等疾病疗效显著[2-3]。但是否可用于乳腺癌、宫颈癌的治疗尚未见明确报道。路路通酸(Betulonic acid,BTA)，又称桦木酮酸，为路路通的主要有效成分[4]，近年来研究发现，BTA具有良好的抗肿瘤活性，对卵巢癌、前列腺癌,人肝癌HepG-2细胞、人胃癌SGC-7901细胞和抗动物移植性S180、H22荷瘤细胞等的增殖有明显抑制作用[5-8]，对乳腺癌和宫颈癌的研究报道较少。本实验就BTA对乳腺癌MCF-7细胞及宫颈癌C-33A细胞增殖的影响及机制进行研究，为进一步临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 路路通酸(BTA)(纯度≥98%)，由中国医科大学药学院中药与生药学教研室提供；人乳腺癌(MCF-7)细胞、人宫颈癌(C-33A)细胞由中国医科大学细胞生物学教研室提供。BTA溶解于二甲基亚砜(DMSO)后配制成10 mmol/L储备液于-20 ℃保存备用。

CO2细胞培养箱(MODEL 3111，美国Thermo)；垂直层流洁净工作台(HCB-1300V，中国海尔)；酶标仪(14495，日本BIO-RAD)；流式细胞分选仪(FACSCAN，美国BD)；DMEM细胞培养基(AAJ307791，美国GE)；RPMI-1640细胞培养基(AAK308935，美国GE)；胰酶(03050-1A，以色列Bioind)；胎牛血清(TBD31HB，天津灝洋)；溴化四氮唑蓝(MTT)(JT343-250MG，美国Genview)；二甲基亚砜(DMSO)(MB-D4253，杭州柯氏)；PI染液(CF0031，北京鼎国)；其余有机试剂为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，人宫颈癌C-33A细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养传代。

1.2.2 MTT法检测BTA对细胞生长活性的影响 取培养至对数生长期的MCF-7细胞和C-33A细胞接种于96孔板内，每孔4 000～5 000个细胞，培养12 h使细胞贴壁。向每孔内加入用对应培养基稀释后的BTA储备液，使终浓度分别为2、4、6、8、10、15、20、25、30、40 μmol/L，每个浓度设5个平行孔。同时设阴性对照孔(含DMSO的培养基溶液)和空白对照孔(只含培养基溶液)。共同培养24、48和72 h后，分别于每孔加入MTT溶液10 μL，继续培养4 h后，吸净上清液并弃掉，每孔加入DMSO 200 μL，37 ℃培养20 min后震荡使结晶完全溶解。酶标仪检测490 nm波长处各孔的光密度值(OD值)，绘制生长曲线，并按以下公式计算细胞生长抑制率(Inhibition rate,IR)：IR=(阴性对照组OD值-加药组OD值)/阴性对照组OD值×100%。以IR值对药物浓度的对数值进行Sigmoidal拟合，计算半数抑制浓度(IC50)值，实验重复进行3次。

1.2.3 流式细胞仪检测BTA对细胞周期的影响 取对数生长期MCF-7细胞和C-33A细胞接种于6孔板内，37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养12 h使细胞贴壁。加入BTA溶液，使药物终浓度达到40 μmol/L，每组设3个对照孔。培养24 h后胰酶消化细胞并收集，加入PBS混匀，1 000 r/min离心5 min后弃去上清，重复2遍后移入1.5 mL离心管，注入0.8 mL预冷的70%乙醇溶液，4 ℃过夜固定细胞。PBS冲洗细胞2次除净乙醇，将细胞重悬于1 mL PI染液，37 ℃避光孵育30 min染色后，上机检测细胞周期，实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件，三次独立实验组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用双样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BTA对2种细胞增殖的影响 MTT法检测结果显示，BTA作用MCF-7细胞24、48、72 h的IC50分别为(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用C-33A细胞24、48、72 h的IC50分别为(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，随着BTA浓度的增加和作用时间的延长，肿瘤细胞受到的抑制作用逐渐增强，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见图1、图2。

图1 BTA对MCF-7细胞的增殖抑制率曲线

图2 BTA对C-33A细胞的增殖抑制率曲线

2.2 流式细胞仪检测BTA对2种肿瘤细胞周期的影响 从图3可见，实验组与对照组G1期细胞分布分别为(44.17%±1.32%) vs.(54.75%±3.23%)；S期分别为(45.32%±3.56%) vs.(31.46%±3.78%)；G2期分别为(10.5%±2.87%) vs.(13.79%±2.37%)；用BTA处理MCF-7细胞后，G1期的细胞比例减少，S期细胞比例增加，细胞阻滞在S期，并且在G0/G1峰前出现凋亡峰。相同浓度下，BTA对C-33A细胞周期抑制情况与MCF-7细胞不同，由图4可见，实验组与对照组G1期细胞分布分别为(83.74%±1.49%) vs.(79.53%±2.18%)；S期分别为(6.55%±0.57%) vs.(12.8%±1.65%)；G2期分别为(9.71%±1.19%) vs.(8.33%±0.89%)，与对照组相比，G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，G1-S期进程受阻，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 流式检测BTA作用MCF-7细胞24 h后细胞周期的变化

图4 流式检测BTA作用C-33A细胞24 h后细胞周期的变化

3 讨论

乳腺癌和宫颈癌是常见的恶性肿瘤，位居全球女性发病和死亡的前2位，治疗多以手术和放化疗为主，对患者不良反应较大[9]。近年来，随着对中医中药抗肿瘤治疗的深入研究，对肿瘤细胞有抑制作用的中药成分逐渐受到人们的重视[10]。BTA是从中药路路通中分离得到的天然产物，文献报道BTA对人鼻咽癌HONE-1细胞、人口腔表皮样癌细胞KB、人结肠癌HT29细胞有细胞毒作用[11]。体内外研究发现，BTA能抑制人肝癌HepG-2细胞和人胃癌SGC-7901细胞的生长，并可促进小鼠肝癌H22细胞凋亡[12]。本研究结果表明，BTA对MCF-7细胞及C-33A细胞的增殖均有较强的抑制作用，并能诱导MCF-7细胞凋亡。

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下自动结束生命的过程，受内在遗传机制调控，主要通过外源性途径、内源性途径和内质网应激触发[13-14]。研究发现，BTA可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，Yang等[10]报道，BTA对胃癌MGC-803细胞和前列腺癌PC3细胞有显著的细胞毒活性。进一步研究发现，BTA通过激活p53蛋白，上调Bax，Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性，触发线粒体凋亡通路引起MGC-803细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。张秀娟等[11]通过对H22荷瘤小鼠的研究发现，BTA可能通过上调p53蛋白的表达诱导H22细胞凋亡，并能阻断G2期、S期细胞向M期的进程，其机制可能与通过抑制PI3K/Akt存活通路有关。细胞周期调控机制的破坏与肿瘤的发生、发展密切相关，本研究结果显示，BTA可引起MCF-7细胞凋亡，使其S期阻滞，与文献报道BTA对H22细胞作用结果一致，推测BTA可激活凋亡蛋白，使细胞停滞在有丝分裂开始之前，从而产生增殖抑制作用；而BTA作用于C-33A细胞后，将其阻滞于G1-S期，使其DNA复制过程受阻，BTA作用于不同细胞系所引起的相关基因或周期蛋白表达的不同，表现在细胞周期被阻滞在不同的阶段，以及是否有凋亡的发生[15]。目前，BTA的抗肿瘤机制研究尚不全面，其对不同成因和发病部位的肿瘤细胞作用靶点不同，由此带来的影响和内在机制有待进一步研究。

综上所述，BTA可以抑制MCF-7细胞以及C-33A细胞增殖，其机制与诱导细胞凋亡、影响细胞周期有关，具体机制还需深入研究，以期为BTA应用于临床治疗提供依据。

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Effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells

MU Xiao-ting,QIAN Ping,JIANG Lu-lu,WANG Yue,JIN Xin,ZHANG Dong-fang*

(Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To study the effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells.Methods MTT assay was used to observe the effect of BTA on growth of cell MCF-7 and cell C-33A in various concentrations for different time periods.Cell cycle and cell apoptosis of these cells were assessed by flow cytometry.Results MTT results showed that the IC50on MCF-7 cells were (37.62±1.72),(27.32±0.99) and (19.19±0.90) μmol/L after being cultured for 24 h,48 h,and 72 h,while on C-33A cells they were (34.55±0.88)，(27.20±1.03) and (16.74±0.79)μmol/L.BTA could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells in a dosage-and time-dependent manner (P<0.05).Flow cytometry analysis showed that BTA could induce MCF-7 cells arrest at S phase,and induce apoptosis,while it induced MCF-7 cells arrest at G1-S phase.Conclusion BTA can inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells;the change of cell cycle and apoptosis may be involved in the process of inhibition.

Betulonic acid;Breast cancer;Cervical cancer;Proliferation inhibition

2016-09-19

中国医科大学药学院中药与生药学教研室，沈阳 110122

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703004