杨振楀，李瑞海，贾天柱

均质法提取侧柏叶中黄酮类化合物的研究

杨振楀1，李瑞海2*，贾天柱2

目的 选择均质法从侧柏叶中提取黄酮类化合物。方法 采用比色法，以芦丁为对照品，建立了含量测定法。采用单因素试验法，对比超声、微波、回流和均质提取法，并利用正交试验，以均质时间、甲醇浓度、料液比和次数4个因素进行考察，结果 总黄酮浓度在0.008 96～0.053 76 mg/mL范围内呈良好的线性关系，加样回收率为102.07，RSD为2.77%。正交试验结果：均质时间15 min，甲醇浓度为70%，料液比1∶10，提取1次。结论 所建立的含量测定法简单易行，均质法比其他方法更为简便，省去对物料粉碎的步骤，且正交试验确定的试验结果稳定、可靠，可用于工业生产。

侧柏叶；总黄酮；芦丁；正交试验；均质法

0 引言

黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一类化合物，常以游离态或糖苷的形式存在，侧柏叶中已知的黄酮类成分除药典规定的槲皮苷外，还含有杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等黄酮类成分。鉴于侧柏叶的黄酮类成分良好的活性作用，拟对其进行进一步研究。均质提取法提取速度快、温度低、能耗低且目的成分得率高。本实验拟选取芦丁为对照品，采用紫外分光光度法对不同方法提取的侧柏叶总黄酮进行含量测定，并利用正交试验法，确定侧柏叶总黄酮成分均质法的最佳提取工艺[1-5]。

1 试剂与试药

1.1 药品与试剂 芦丁(大连美仑生物技术有限公司20130528)；侧柏叶经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定均为柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶；甲醇、稀乙醇、石油醚(60～90 ℃)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 分光光度计(日本日立)；UV Solutions 2.1工作站；ESB-500高剪切均质乳化机(上海易勒机电实验室)；HH-4数显恒温水浴锅(荣华仪器制造有限公司)；超声波提取器(奥特赛恩斯仪器有限公司)；0.000 01 g电子天平(SARTORIUS CP225D)。

2 方法

2.1 侧柏叶总黄酮类成分含量测定方法的建立

2.1.1 芦丁标准品溶液[1]精密称取干燥至恒定质量的芦丁对照品适量，置于100 mL容量瓶中，加入50%乙醇使其溶解定容至刻度，摇匀，制得浓度为0.224 0 mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取侧柏叶样品，粉碎，研细后精密称取1.0 g，置于索氏提取器中，加入石油醚(60～90 ℃)25 mL回流提取4 h，弃去石油醚提取液，药渣挥干，加甲醇25 mL回流提取至无色，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 测定法及最大吸收波长的确定 取上述芦丁对照品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min，加氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，以相应试剂作为空白，在波长200～800 nm范围内扫描，确定芦丁的吸收波长为510 nm。见图1。

图1 芦丁对照品200～800 nm范围扫描曲线

2.1.4 芦丁对照品标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，置于25 mL的容量瓶中，加水6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min，加氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，以相应试剂作为空白，在510 nm处测定吸收度。以对照品的浓度(C，mg/mL)作为横坐标、吸收度(A)作为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：A=12.494 C-0.017 5(r=0.999 8)，结果显示，以芦丁为对照的总黄酮浓度在0.008 96～0.053 76 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取同一芦丁对照品溶液，按“2.1.3”项下同法操作连续测定吸光度6次，结果RSD为0.22%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一样品，各1.0 g，精密称定，按“2.1.2”项下制备方法，制备样品溶液，精密吸取供试品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按标准曲线绘制项下的方法，自“加水6 mL”起，依法测定吸光度，结果RSD为1.60%，表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按标准曲线绘制项下的方法，自“加水6 mL”起，按0、10、20、30、40、50、60 min时间间隔依法测定吸光度，结果RSD为0.37%，表明总黄酮性质较稳定，样品液在60 min内测定，结果可靠。

2.1.8 加样回收试验 精密称取已知含量的样品0.5 g，精密加入芦丁对照品适量，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法操作，精密吸取供试品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按标准曲线绘制项下的方法，自“加水6 mL”起依法测定吸光度，计算含量及回收率。

2.2 常见提取方法的比较(见表1)

2.2.1 超声提取 称取侧柏叶粉1.0 g置于锥形瓶中，加甲醇溶液10 mL，于超声波清洗仪中常温超声提取30 min，超声频率100 Hz，过滤，滤饼再重复提取2次，合并3次提取液，减压浓缩至干，按“2.1.3”项测定法，按“2.1.4”项标准曲线测定样品含量。

2.2.2 微波提取 称取侧柏叶粉1.0 g置于锥形瓶中，甲醇水溶液10 mL，于高火下加热至刚沸腾即停止加热约1 min后再加热，反复多次，直至累计加热10 min，滤过，滤饼再重复提取2次，合并滤液，合并3次提取液，减压浓缩至干，按“2.1.3”项测定法，按“2.1.4”项标准曲线测定样品含量。

2.2.3 回流提取 称取侧柏叶粉1.0 g置于圆底烧瓶中，加甲醇溶液10 mL，水浴中70 ℃加热回流提取，回流提取2 h后过滤，滤饼再重复提取2次，合并滤液，合并3次提取液，减压浓缩至干，按“2.1.3”项测定法，按“2.1.4”项标准曲线测定样品含量。

2.2.4 均质提取 称取侧柏叶粉1.0 g置于锥形瓶中，加甲醇溶液10 mL，均质提取5 min，过滤，滤饼再重复提取2次，合并3次提取液，减压浓缩至干，按“2.1.3”项测定法，按“2.1.4”项标准曲线测定样品含量。

2.3 正交试验优选 以均质时间、甲醇浓度、料液比和次数4个因素进行考察，每个因素3个水平，采用L9(34)正交试验优选提取工艺。因素水平见表2。以芦丁为对照的总黄酮含量进行评价，进行提取工艺条件优选。正交试验结果见表3，方差分析见表4。因素指标相关图见图2。

表1 常见提取方法的比较

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验表及含量测定结果

图2 因素指标相关图

变异来源离均差平方和自由度(n)均方(MS)F值P值均质时间(min)0.0544020.0271824.54<0.05甲醇浓度(%)0.0754320.0377134.05<0.05料液比0.0022120.001111.00—次数0.0299520.0149713.52>0.05合计0.16200

注：F0.05(2.2)=19.00

由R值可知，各因素对总黄酮类成分提取的影响大小顺序为B>A>D>C；方差分析结果B因素(甲醇浓度)具有显著影响。最后确定提取工艺为A3B2C1D1，即均质时间15 min，甲醇浓度为70%，料液比1∶10，提取1次。

2.4 重复性实验 按优选的提取工艺提取3批侧柏叶总黄酮，测定其含量，结果为0.483%±0.10% (n=3)。

3 讨论

3.1 预试验中首先对提取溶剂进行选择，经查阅文献，发现黄酮类成分一般采用甲醇和乙醇提取，经比较，甲醇和乙醇的提取中两者并无著差异，与乙醇相比，甲醇的黏度较低，在过滤时阻力相对较小，易操作，最后确定甲醇为提取溶剂，在对比不同浓度甲醇提取时发现，30%甲醇和甲醇(即低浓度甲醇和高浓度甲醇提取，含量均低)，最后确定50%、70%、90%甲醇作为提取浓度水平。预试验中发现，均质提取时间长，提取完全，但超过10 min后，没有太大的变化。料液比对于提取有很大影响，预试验发现，料液比为1∶40时，含量不再增加。预试验发现，温度对于均质提取并没有太大影响，因此本次实验不作考察。最后确定均质时间、甲醇浓度、料液比和次数4个因素，每个因素3个水平进行考察。

3.2 由表2的R值可知，各因素对总黄酮类成分提取的影响大小顺序为B>A>D>C；以R值最小的D提取次数为误差项进行方差分析，结果A因素均质时间和B因素甲醇浓度对总黄酮提取具有显著影响，因此选择其相应的最高水平。由方差分析结果表明，料液比和次数均不是影响实验的主要因素，因此可选择利于生产的相关水平，在生产中料液比高、提取次数多会增加溶剂量，给后续的浓缩等操作带来很大的负担，也会使工艺更加繁琐。故确定提取工艺为A3B2C1D1，即均质时间15 min，70%甲醇，料液比1 ∶10，提取1次。

3.3 由表1常见提取方法的比较结果可知，微波提取、回流提取和均质提取法含量较高，超声提取法提取成分的含量较低。回流提取较为传统、可靠，但操作繁琐是其主要的问题。微波提取和均质提取是新兴提取方法，具有优势，主要表现在操作简单。与回流比较，不需要长时间加热，热敏性成分会受到破坏，同时能源消耗量大。与微波提取法相比，均质提取法更具有优势，减少了粉碎的环节，提取率较高，因此，本研究主要针对均质提取法对侧柏叶进行研究，以利其在实验和生产中广泛应用。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:32.

[2] 马彦芳.金银花中总黄酮的含量测定[J].青海科技,2007,14(4):29-30.

[3] 徐军,李瑞海.用HPLC法测定心通片中葛根素的含量[J].实用药物与临床,2008,11(2):120-121.

[4] 李宇馨,李瑞海.小檗碱抗炎活性研究[J].实用药物与临床,2013,16(1):43-44.

[5] 谭晓亮,李瑞海,贾天柱.侧柏叶炮制前后成分的对比[J].实用药物与临床,2015,18(11):1359-1362.

Extraction of flavonoid compounds fromCacumenplatycladiby homogeneous method

YANG Zhen-yu1,LI Rui-hai2*,JIA Tian-zhu2

(1.Shenyang Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100020,China;2.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To extract the flavonoids fromCacumenplatycladiby homogeneous method.Methods The content determination method was established by colorimetric method with rutin as the reference substance.The ultrasound,microwave,reflux and homogeneous extraction method were compared using the single factor experiment method,and the orthogonal test was used with homogeneous time,methanol concentration,solid-liquid ratio and times as four factors were.Results Total flavonoids had good linear relationship in the range of 0.008 96～0.053 76 mg/mL,the average recovery rate was 102.07 andRSDwas 2.77%.Orthogonal test results were as follows:the homogeneous time was 15 min,methanol concentration was 70%,and the material-liquid ratio was 1∶10,extraction for 1 time.Conclusion The established method for content determination is simple and feasible,in which the homogeneous method is simpler,and it can save the procedure of material crush.The established orthogonal test has stable and reliable results,which can be used in industry production.

Cacumenplatycladi;Total flavonoids;Rutin;Orthogonal test;Homogeneous method

2016-07-18

1.沈阳市中医院，沈阳 100020；2.辽宁中医药大学药学院，大连 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703020