祝凯丽

（青岛农业大学，山东 青岛 266109）

海藻酸钠对生鲜鸡肉肌原纤维蛋白冻融引起的功能性和流变性影响

祝凯丽

（青岛农业大学，山东 青岛 266109）

本试验采取对添加海藻酸钠的试验组和未添加海藻酸钠的对照组进行反复冻融4次，通过测定每次冻融后的样品进行样品蛋白含量、盐溶性蛋白含量、乳化性、总巯基含量、蛋白质Ca2+--ATPase活性、蛋白质热稳定性的测定、肌原纤维蛋白SDS-PAGE的分析和动态流变性的方法，探究海藻酸钠对反复冻融的生鲜鸡肉中所提取的肌原纤维蛋白所引起的功能特性和流变特性的影响。结果表明，随着反复冻融次数的增加，样品蛋白含量、盐溶性蛋白含量、乳化性、总巯基含量、蛋白质Ca2+--ATPase活性和蛋白质热稳定性均是逐渐降低的，试验组样品各指标的降低程度小于对照组。蛋白质的动态流变学特性的测定说明试验组比对照组的凝胶能力强，变性温度高,为生产加工提供理论依据。

肌原纤维蛋白；海藻酸钠；反复冻融；蛋白质变性

反复冻融使样品中小冰晶体重结晶从而在肌原纤维中重新分布，导致细胞结构被破坏，肌原纤维蛋白变性，质构变化，降低了动物产品的食用价值[1]。肌原纤维蛋白是由肌球蛋白、肌动蛋白、肌动球蛋白以及被称为调节蛋白的原肌球蛋白、肌钙蛋白所组成的复合体[2]，因此反复冻融过程中肉类蛋白的变性主要是肌原纤维蛋白的变性[3]。肉类中肌原纤维蛋白的冷冻变性导致蛋白质的结构和功能特性发生改变，但并不破坏蛋白质的一级结构，此现象称为蛋白质的变性[4]。

海藻酸钠是从褐藻植物中提取的一种天然多糖类物质，是由α-L-甘露糖醛酸（M段）和β-D-古罗糖醛酸（G段），通过1,4-糖苷键连接而成，分子式：（C6H 7O 6N a）n[5]，在食品工业中被广泛用作稳定剂、增稠剂、粘结剂、乳化剂和凝固剂等[6]，可增加肉制品的胶着性、持水性和柔嫩性，减少营养成分损失，提高了产品的质量[7]。本试验采取对添加海藻酸钠的试验组和未添加海藻酸钠的对照组进行反复冻融4次，测定指标，为实际的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器设备

1.1.1试验材料与试剂材料：正大新鲜鸡大胸肉（大润发超市购买）。

主要试剂：Tri s-m al eate缓冲液、三氯乙酸（TCA）、硫酸亚铁-钼酸铵、0.1 m ol/L CaCl2、0.02 m ol/L ATP、双缩脲试剂、玉米油、0.2 m ol/ L Tri s-H Cl（pH 6.8）、0.1%DTN B、蛋白质M arker（14.4～116.0 KD）、过硫酸铵（APS）等。

1.1.2仪器设备UV-2000型紫外可见分光光度计、电子分析天平（型号：TE124S）、电子天平（型号：008040）、高速冷冻离心机、凝胶成像仪、差示扫描量热仪、动态流变仪（型号：M CR102）等。

1.2试验方法

1.2.1样品的预处理选购新鲜的同一批次的鸡胸脯肉，去除表面脂肪组织和结缔组织，然后将其顺肌原纤维方向分割为大小1 cm3的肉块，将分割好的肉块分为两份，一份为试验组，另一份为对照组。试验组肉块浸泡在0.4%的海藻酸钠溶液中1 h，用镊子夹出放入3个自封袋中，每袋100 g，分别编号为试验1组、试验2组、试验3组。同时，对照组不做任何处理的肉块也分别放入3个自封袋中，每袋100 g，分别编号为对照1组、对照2组、对照3组。将试验组和对照组的样品放入-18℃的冰箱中冷冻4 d，过后，将其转移至4℃冷藏室中解冻12 h，即冻融一次完成。从每个自封袋中各取25 g肉块用绞肉机粉碎，进行试验各指标的测定。然后再将剩余样品放入-18℃的冰箱中冷冻4 d，依此方法反复冻融4次，每一次相应的做各指标的测定。

1.2.2CCMP的提取和测定采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白含量。用电子分析天平准确称取酪蛋白0.05 g溶于0.05 m ol/L的N aO H溶液中，并定容至10 m L，即为5 m g/m L的标准蛋白溶液，取12支试管分为两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L的标准蛋白溶液，用水补足到l m L，在每个试管中加入4 m L双缩脲试剂，得到每管中的蛋白质含量分别为0、1、2、3、4、5 m g，充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30 m i n，于540 nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3盐溶性蛋白含量测定在蛋白质溶解后，取0.5 m L于试管中，加水至1 m L，加入双缩脲试剂4 m L，充分混匀后，在室温下（20～25℃）静止10 m i n，测吸光度，平行测3次。

1.2.4生化活性数据测定对肌原纤维蛋白Ca2+--ATPase活性、标磷、Ca2+--ATPase活性、肌原纤维蛋白乳化特性、总巯基含量、DSC蛋白质热稳定性、SDS-PAGE（SDS-凝胶电泳）、动态流变性分别进行测定，用EXCEL对测定指标进行统计分析

2 结果与分析

2.1海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白含量的影响

2.1.1蛋白质标准曲线见图1。

2.1.2蛋白质含量的测定见图2。图2表明，随着冻融次数的增加，对照组和试验组的蛋白质含量都呈现逐渐减少的趋势，这是由于反复冻融使样品中的冰晶体重结晶从而在肌原纤维中重新分布，导致细胞结构被破坏，肌原纤维蛋白变性。而试验组肌原纤维蛋白变性趋势较对照组肌原纤维蛋白变性趋势平缓，这是由于海藻酸钠在冷藏制品的加工中可以较好地抑制冰晶体的增长，能够较好地缓解由于温度波动而使肌原纤维蛋白变性的现象。

2.2海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白中盐溶性蛋白含量变化见图3。

图1 蛋白质标准曲线Fig.1The standard curve of protein

图2 样品蛋白含量变化Fig.2The change of protein content in samples

图3 盐溶性蛋白含量变化Fig.3The change of salt soluble protein content

在反复冻融过程中，肌原纤维蛋白部分结合水形成冰晶，这使得肌动球蛋白分子之间可以相互形成非共价键（疏水键和氢键），进而形成超大分子的不溶性凝集体，导致在冻藏过程中其溶出量不断下降[8]。盐溶性蛋白的减少是蛋白质变性的一个主要指标，这与氢键和疏水键的结构和二硫键同离子的相互作用有关[9]。试验结果显示，对照组的盐溶性蛋白和试验组的盐溶性蛋白都呈现出下降趋势，但两组试验下降趋势平缓程度接近，出现这种情况的原因可能是海藻酸钠对于盐溶性蛋白提取的影响是不明显的。

2.3海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白CCaa22++----ATTPPaassee活性的影响

2.3.1标磷测定见图4。

2.3.2Ca2+--ATPase活性的测定见图5。

ATPase活性是个非常好的表现蛋白质分子完整性的指标[10]，ATPase活性降低说明了反复冻融破坏肌原纤维蛋白的完整性，进而会降低肌原纤维蛋白的功能特性，特别是凝胶特性[11]。可见海藻酸钠能够防止肌原纤维蛋白Ca2+--ATPase活性大幅下降，从而很好地抑制肌原纤维蛋白变性。

2.4海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白乳化性的影响见图6。

图4 磷酸量标准曲线Fig.4The standard curve of phosphoric acid

图5 Ca2+--ATPase活性变化Fig.5The change of Ca2+--ATPase activity

图6 肌原纤维蛋白乳化活性指数和乳化稳定性指数的变化Fig.6The change of myofibril protein’s EAI and ESI

蛋白质的乳化特性表明蛋白质与蛋白质、蛋白质与脂肪交联的能力，蛋白质乳化性和乳化稳定性受很多因素的影响[12]。试验结果显示，试验组和对照组的EAI、ESI都呈现逐渐降低的趋势，说明随着反复冻融次数的增加，肌原纤维蛋白的乳化活性逐渐降低，乳化稳定性也呈降低趋势，因为反复冻融的次数增多，使其改变了蛋白质的结构，肌原纤维的交联程度增大，使蛋白质发生了变性，增加了表面疏水性，降低了蛋白质的凝胶特性，丧失了表面吸附脂肪颗粒的灵活性[13]。图示表明试验组的乳化活性和乳化稳定性都较对照组高，这说明海藻酸钠作为乳化剂添加在肉样中，能够使提取的肌原纤维蛋白分散均匀，使蛋白质凝胶体系更加稳定，乳化活性提高。

2.5海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白总巯基含量的测定见图7。

图7总巯基含量的变化Fig.7The change of the total sulphur content

图7 表明，随着冻融次数的增加，试验组和对照组肌原纤维蛋白总巯基含量都有明显的下降趋势。在第一次冻融过程中，试验组和对照组总巯基含量大致相同，变化不明显，而在第一次冻融后总巯基含量明显降低且试验组总巯基含量明显高于对照组总巯基含量。在反复冻融过程中总巯基含量的减少是因为肌原纤维蛋白的巯基被氧化，肌球蛋白分子变性加剧，头部构象发生变化，活性巯基暴露而被氧化[14]。而试验组巯基含量高于对照组巯基含量是因为海藻酸钠的凝胶特性，维持肌原纤维蛋白的三维结构，保护巯基不被氧化。

2.6海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白热稳定性的影响

表1 差示扫描热量计（DSC）分析结果Table1Results of DSC analysis

表1表示了冻融次数对未添加海藻酸钠的鸡肉峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ变性温度和变性焓值的影响，随着冻融次数的增加，第一个峰的变性温度呈逐渐减小的趋势，这种趋势说明随着冻融次数的增加，肌球蛋白越易变性，而肌浆蛋白和肌动蛋白变性温度没有明显的规律，不能判断冻融次数对这两种蛋白质变性的影响。添加加海藻酸钠的鸡胸肉分别在1次冻融、2次冻融、3次冻融、4次冻融后的肌肉蛋白质DSC热流图，图中每个曲线都有2个吸收峰：58℃左右和77℃左右，说明这两个吸收峰分别是肌球蛋白头部变性和肌动蛋白变性引起的，肌浆蛋白和肌球蛋白尾部的焓变点未在DSC谱图上显示，说明海藻酸钠的添加影响了肌浆蛋白和肌球蛋白尾部的变性。

由表2呈现的数据趋势分析可知，肌球蛋白的变性温度波动幅度不明显，说明添加海藻酸钠的样品肌原纤维蛋白变性不明显。而焓值除个别数据出现很大程度的偏差外其余呈下降趋势，说明肌原纤维蛋白随着冻融次数的增加也有一定程度的变性。

2.7海藻酸钠对反复冻融的肌原纤维蛋白流变学特性的影响见图8和图9。

表2 差示扫描热量计（DSC）分析结果Table2Results of DSC analysis

图8 反复冻融对对照组肌原纤维蛋白的温度扫描谱图Fig.8The temperature scanning spectra of the control group that repeated freezing and thawing four times

图9 反复冻融对试验组肌原纤维蛋白温度扫描谱图Fig.9The temperature scanning spectra of the experimental group that repeated freezing and thawing four times

通过对肌原纤维蛋白溶液应力扫描确定线性粘弹区，确定了最佳应变为0.5%，频率设置在0.1～10 H z。上述图显示，在相同的震荡频率下，不同冻融次数的添加海藻酸钠的试验组中的G′均高于未添加海藻酸钠的对照组样品的G′。这种结果表明海藻酸钠的添加增加了体系的凝胶弹性。

3 小结

生鲜鸡肉的反复冻融能够改变肌原纤维蛋白的结构，随着反复冻融次数的增加，肌原纤维蛋白的含量，肌原纤维蛋白的Ca2+--ATPase活性、总巯基含量、乳化性都是逐渐降低的，通过DSC谱图分析，随着反复冻融次数的增加，热转变温度和焓值都是逐渐降低的；肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳谱图分析结果显示，反复冻融次数越多，蛋白质降解越明显。反复冻融过程改变了蛋白质分子的结构，从而影响鸡肉肌原纤维蛋白的功能特性。通过肌原纤维蛋白流变学特性的变化分析，反复冻融的过程降低了蛋白质的凝胶化作用，使得流变学参数储能模量G′值明显降低。

海藻酸钠作为食品添加剂添加到低温肉制品中，可改善肉制品的物理性质，增加粘度，富于其良好的口感，同时可增加肉制品的胶着性、持水性和柔嫩性，减少营养成分损失，从而提高了产品的质量。添加海藻酸钠的试验组相对于对照组能够减缓蛋白质的变性速率，使得试验中各指标都显著高于未添加海藻酸钠的对照组。蛋白质的动态流变学特性的测定也说明试验组比对照组的凝胶能力强，变性温度高。许多研究人员将海藻酸和海藻酸钠/钙应用于肉制品中，以改善肉类产品的结构。添加海藻酸钠的肌原纤维蛋白经过反复冻融，蛋白质变性能够得到极大的改善。

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The effects of the functional characteristics and the rheological properties on myofibril protein that caused by sodium alginate

Zhu Kai l i
(Q i ngdao agri cul tural uni versi ty,ShandongQ i ngdao266109)

Addi ng sodi um al gi nate group and w i thout addi ng sodi um al gi nate w i th a controlgroup repeated freezi ng and thaw i ng on 4 ti m es.M easuri ng the sam pl es every ti m e afterfreezi ng and thaw i ng,sal tsol ubl e protei n contenti n the sam pl e protei n,em ul si fi cati on,totalsul phur content,Ca2+protei n ATPase acti vi ty and protei n determ i nati on of therm alstabi l i ty,m yofi bri lprotei n sds-page anal ysi s and dynam i c rheol ogi calm ethod.Expl ori ng the functi onaland characteri sti cs on repeated freezi ng and thaw i ng raw chi cken.The resul ts show that w i th the num ber i ncreasi ng,the repeated freezi ng and thaw i ng sam pl e protei n content,sal t sol ubl e protei n content,em ulsi fi cati on,totalsul phur content,Ca2+-protei n ATPase acti vi ty and protei n therm alstabi l i ty are gradual l y reduced.Extent of the test sam pl es of each i ndex w as l ess than the controlgroup.Dynam i c rheol ogi calproperti es ofprotei n determ i nati on show ed that experi m entalgroup i s stronger than the controlgroup i n the gelcapabi l i ty.And the tem perature i s hi gher than controlgroup. Thi s paperprovi ded theoreti cal basi s for producti on and processi ng.

M yofi bri l protei n;Sodi umal gi nate;Repeated freezi ng;Thaw i ng protei n degenerati on

TS251.1

B

1672-9692(2016)07-0006-08

2016-05-26

祝凯丽（1982-），女，专科，主要从事肉鸡品质检测工作。