杨卓

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁 大连 116037）

LAMP研究中的常见问题分析及解决方法

杨卓1，2

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁 大连 116037）

本文通过《小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测和鉴别方法的建立》研究中的相关扩增曲线和试验结论，对LAMP研究中出现的几种问题进行了初步探讨，并提出解决方案。文章从气溶胶污染、非特异性扩增、扩增效率不高和扩增曲线常见问题分析等方面，分析其产生原因并总结了相关解决办法，从而为今后的LAMP技术研究和推广做出贡献。

LAMP技术；气溶胶污染；非特异性扩增；扩增效率不高；扩增曲线

环介导恒温核酸扩增技术（l oop-m edi ated i sotherm al am pl i fi cati on of DN A，LAM P）是由N otom i等于2000年发明的一种恒温、快速、高特异性和操作简便的分子生物学检测技术。其反应原理是：根据序列保守区域设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60 m i n内，大量合成目标DN A，同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生[1]。LAM P技术以其自身的优势，在国际上已成为了分子生物学检测技术的研究热点，也被应用于多种疾病的检测，例如小反刍兽疫病毒[2]、日本脑炎病毒[3]、口蹄疫病毒[4]、H 5N 1禽流感病毒[5]和结核分枝杆菌[6]等。

对于LAM P反应的结果判定，目前有四种方式：眼观白色沉淀检测法（简称“目测法”）、荧光指示剂法、传统的琼脂糖凝胶电泳检测和浊度仪的实时浊度法。前两种方法仅通过肉眼判定，误差较大，不适用于科学研究；第三种方法无法判定反应中是否出现污染、二聚体扩增等假阳性情况，从而得不到准确、高效的反应体系；而利用浊度仪，采用实时浊度法，能够使整个反应都在密闭条件下进行，从而最大程度地避免污染，并且能够实时监测反应过程中所产生的白色焦磷酸镁沉淀，并绘制成扩增曲线。通过对曲线形态的分析，能够客观准确的排除假阳性结果；通过沉淀产生的起始时间判断反应的进行程度；通过浊度值的高低和反应开始时间的快慢来优化、最后确定最佳反应体系[7]。因此，实时浊度法成为了LAM P研究中，确定和分析反应结果的主流方法。笔者以在LAM P研究中几种常见问题为例，对其产生的原因进行分析并提出相应的解决方法，从而促进LAM P法的推广和更深层次的研究。

1 试验仪器

浊度仪，型号为La-320C，La-500。

2 试验试剂

核酸提取试剂盒，购自Invi trogen公司；LAM P法RN A扩增试剂盒（RN A Am pl i fi cati on Ki t），购自日本荣研化学株式会社；LAM P反应管（Reacti on Tube），购自日本荣研化学株式会社。

3 扩增曲线来源

《小反刍兽疫病毒RT-LAM P快速检测和鉴别方法的建立》研究中的相关扩增曲线。

4 试验中的常见问题

4.1气溶胶污染根据LAM P反应可知，其反应过程可对靶序列的4～6个区域进行扩增，反应产物可达到PCR反应的102～103倍，反应过程中极易产生气溶胶污染，是LAM P研究中应首要避免的因素之一。其解决方法：①严格核酸提取和扩增进行分区；②反应全程禁止开启反应管。

4.2非特异性扩增由于LAM P反应对靶序列的扩增区域较多，因此与PCR技术相比较容易出现非特异性扩增的现象。除了技术本身的特点以外，导致LAM P反应出现非特异性扩增的因素还有很多，例如M g2+的浓度、引物特异性欠佳、反应温度等。解决此类问题的方法：①在设计引物时要寻找高保守特有序列；②引物设计完成后应利用O l i go等分子生物学分析软件对其进行二聚体情况分析；③在试验研究中最好采用特定的LAM P研究试剂盒，或者进行M g2+浓度的筛选试验，以确定反应的最佳环境；④需要进行最佳反应温度筛选试验。通过以上方法，寻找出最佳反应体系，从而最大限度地避免非特异性扩增的产生。

4.3扩增效率不高笔者试验中积累得出以下经验：通常LAM P反应在开始后10～20 m i n便可出现浊度的变化，即扩增反应开始；若在反应25 m i n后才出现扩增，则该体系不是最佳的反应体系，应及时查找原因进行优化。在优化体系过程中应首先排除体系污染、非特异性扩增、引物质量欠佳等情况。若仍不能解决，应考虑引物比例是否得当。通常引物的常用比例为FIP（BIP）：LF（LB）:F3（B3）=8:4:1，但对于不同靶序列，该比例组合未必最佳，因此需重新探索引物比例。

4.4扩增曲线中的常见问题分析

图1 正常扩增曲线Fig.1Normal amplification curve

4.4.1正常扩增曲线图片来自La-320C型浊度仪。在利用浊度仪进行的LAM P研究中，可同时绘制出反应的扩增曲线和速率曲线，扩增曲线代表焦磷酸镁的沉淀量，以浊度值表示，用于判定反应结果；速率曲线代表反应效率，在分析检测结果时起到辅助作用。正常的扩增曲线和速率曲线如图1和图2。由图1可见，反应初期迅速产生大量焦磷酸镁沉淀，反应体系浊度迅速上升，随后沉淀产生速度变慢，曲线变化趋于缓和；同时图2与图1相互印证，即初期反应速率较高，到达峰值之后速率逐渐下降至末期趋于反应平衡状态。

图2 正常速率曲线Fig.2Normal judgment curve

图3 扩增曲线Fig.3Amplification curve

图4 速率曲线Fig.4Judgment curve

4.4.2异常扩增曲线

4.4.2.1核酸浓度过高图片来自La-500型浊度仪。如图3扩增曲线所示，CH 6反应孔（称之为“样本A”）的浊度值呈直线上升；图4速率曲线在反应初期迅速上升并迅速下降至负值，且无反应平衡期。此种情况为样本核酸浓度过高，解决方法为：将样本进行梯度稀释后再次进行扩增。

4.4.2.2引物扩增速率过快图片来自La-320C型浊度仪。如图5扩增曲线所示，CH 1（称之为“样本B”）和CH 4（称之为“样本C”）反应孔反应开始后，浊度值仅有微小上升，便迅速下降且降至基准线以下。从图6速率曲线所示，反应开始后不久便达到反应平衡状态。结合两种图像分析，出现此种情况的原因为：体系的反应速率过快。浊度仪默认的浊度监测开始时间为反应进行10 m i n后，若反应速率过快，浊度仪开始进行监测前反应体系便已经生成大量沉淀并累积在试管底部，从而使浊度仪绘制的反应曲线不准确，由此出现图5所示情况。解决方法：①将浊度仪O pti ons选项中Ignore（Bef.）Ti选项设定的浊度监测起始时间缩短；②对将样本进行梯度稀释。

4.4.3进行相关调整后的反应曲线根据提供的相关解决方案：①将A样本进行10倍稀释；②将B和C样本进行10倍稀释的同时，调整浊度仪O pti ons选项中Ignore（Bef.）Ti，使浊度监测时间变更为5 m i n。再次进行扩增反应，得出以下曲线，图7为扩增曲线，图8为速率曲线。

图5 扩增曲线Fig.5Amplification curve

图6 速率曲线Fig.6Judgment curve

通过试验证实，以上解决方案均为有效方案，再次对样本进行扩增后取得了理想的扩增效果。

5 小结

LAM P技术由于具有恒温、操作简单、对仪器设备要求低等优点，已被许多行业应用到多种类型的实验室及临床检测中。但由于其扩增产物量巨大、扩增位点较多，也产生了反应体系易污染和非特异性扩增等问题。文章对气溶胶污染、非特异性扩增、扩增效率不高和扩增曲线常见问题的探讨和解决，有利于LAM P技术更广泛的推广和应用，从而发挥其更大的价值。

图7 扩增曲线Fig.7Amplification curve

图8 速率曲线Fig.8Judgment curve

[1]LI Xue-l i an,LIU W ei,W AN G J i e,et al.Rapi d detecti on ofTri chi nel l a spi ral i sl arvae i n m uscl es by l oop-m edi ated i sotherm alam pl i ficati on[J].IntJParasi tol,2012,42(13-14): 1119-1126.

[2]杨卓，于汉勋，李巍.小反刍兽疫病毒RT-LAM P检测方法的研究[J].现代畜牧兽医，2015，7：8-14.

[3]Tori ni w aH,Kom i yaT,Rapi d detecti on and quanti fi cati on ofJ apaneseencephal i ti svirus by real-ti m e reverse transcri pti on l oopm edi ated i sotherm alam pl i fi cati on[J].M i crobi ol Im m unol,2006,50:379-387.

[4]李健，陈沁，熊祎，等.口蹄疫病毒RT-LAM P检测方法的建立[J].病毒学报，2009，25（2）：137-142.

[5]马启明，马学军，高寒春，等.逆转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAM P）在H 5N 1禽流感病毒基因检测中的应用[J].病毒学报，2008，24（3）：178-184.

[6]黄帆，李琳，林世平，等.DN A环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究[J].现代食品科技，2008，24（8）：835-838.

[7]杨卓，于汉勋，李巍.小反刍兽疫病毒RT-LAM P快速检测与鉴别方法的建立[J].中国兽医科学，2015，45（9）：930-936.

Some problems and relevant solutions on LAMP research

Yang Zhuo1,2
(1.DaLi an Center forAni m al Di sease Preventi on and Control,Li aoni ngDal i an116037; 2.DaLi an Ani m al H usbandry Stati on,Li aoni ngDal i an116037)

Thi s arti cl e w as based on the records of Establ i shm ent of RT-LAM P for the detecti on and di fferenti ati on ofpeste des peti ts rum i nants vi rus.Som e probl em s i n the research ofLAM P w ere di scussed,and the sol uti ons w ere put forw ard.A few si tuati ons,such as aerosolpol l uti on, nonspeci fi c am pl i fi cati on,l ow effi ci ency ofam pl i fi cati on,and som e probl em s i n am pl i fi cati on curve had been di scussed deepl y.And thi s arti cl e sum m ari zed the rel evant sol uti ons for the si tuati ons above.Thi s arti cl e had som e contri bute to the research and prom oti on of LAM P technol ogy.

LAM P technol ogy;Aerosol pol l uti on;N onspeci fi c am pl i fi cati on;Low effi ci ency of ampl i fi cati on;Am pl i fi cati on curve

S852.65

B

1672-9692(2016)07-0053-05

2016-06-11

杨卓（1982-），女，大学本科，学士，兽医师，研究方向：动物疫病诊断及防控。