郑淑娟 仝涛，2 许文涛，2，3 黄昆仑，2，3

（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083；3. 农业农村部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京 100083）

点击化学反应是通过碳-杂原子键的连接快速合成有用的新化合物的反应，由化学家Sharpless、Kolb及Finn于2001年提出后受到越来越多的关注［1］。点击化学有以下一种或多种特征：反应快速；通量合成高；操作简单；反应条件温和；原料来源广；反应产物易纯化，产物得率高［1］。

点击反应的有多种，包括环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化反应、碳-碳多重键加成反应、叠氮-膦偶合反应。狄尔斯-阿尔德反应（Diels-Alder reaction）和 1，3-偶极-环加成反应（copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）属于环加成反应；氮丙啶、环氧化物和环状硫酸酯等发生的反应属于亲核开环反应；腙、肟醚和芳香族杂环的形成属于非醇醛的羰基化反应；二羟基化反应和环氧化反应属于碳-碳多重键加成反应；施陶丁格连接属于叠氮-膦的偶合反应。

按照是否需要金属作为反应催化剂可以将点击反应分为金属催化的点击反应和无金属催化的点击反应。如CuAAC为金属催化的点击反应，而叠氮-炔环加成反应（strain-promoted alkyne-azide cycloadditions，SPAAC）和巯基-烯（thiol-ene）点击反应则为无金属催化的点击反应。金属催化的点击反应在生物学领域的使用具有一定的限制性，因金属离子难以被纯化分离，而且具有潜在的生物毒性作用，可能会损害机体健康。因此，无金属催化的点击化学反应如狄尔斯-阿尔德反应、施陶丁格连接和巯基-烯点击反应受到了广泛的关注。

在材料合成和生物分子标记中，巯基-烯点击反应都发挥着重要的作用。巯基-烯点击反应被广泛的应用于生物大分子的合成如树枝状化合物的合成和聚合物的合成等方面。巯基-烯点击反应还可以应用于蛋白质、核酸链和聚糖等生物分子的标记中。另外，巯基-烯点击反应在材料表面功能化方面也具有很重要的作用。在生物传感方面，巯基-烯点击反应具有广阔的应用前景。本文对巯基烯点击反应进行了综述，详细介绍了巯基-烯点击反应的反应机理、影响反应速率的因素和生物大分子的标记。并且介绍了巯基-烯点击反应介导的生物传感器及与生物传感相关的应用，包括生物功能化纳米材料和细胞成像等方面。最后对巯基-烯点击反应在生物传感领域的发展进行了展望。

1 巯基-烯点击反应偶联机理及性质

硫醇-烯点击反应通常包括自由基介导的巯基-烯点击反应和亲核试剂催化的巯基-迈克尔加成反应（图1）。自由基引发的巯基-烯反应机理可以分为以下几个步骤：首先，在加热或光照的条件下，引发剂吸收能量被激发裂解，形成自由基；接着，形成的自由基和巯基发生反应，夺取巯基上的氢原子，触发巯基自由基形成；然后，形成的巯基自由基和烯基发生反应，形成烷基自由基；最后，烷基自由基会进攻巯基化合物，夺取巯基上的氢原子，引发链增长，同时产生新的巯基自由基。这些新产生的巯基自由基可继续和烯基反应。其中第二步产生的巯基自由基可引发链增长也可以发生双基终止［2］。亲核试剂催化的巯基-迈克尔加成反应的反应机理包括以下步骤：硫醇与亲核试剂的反应促使巯基去质子化，成为相应的硫酸盐阴离子。硫酸盐是一种很强的亲核体，与活化的C=C加成，形成中心碳为阴离子的中间体。之后这个中间体吸收一个质子，形成巯基-烯产物［3］。

图1 常见的巯基-烯点击化学反应类型［4］Fig. 1 Common types of thiol-ene click chemistry reactions

近几年，巯基-烯反应点击化学的特性受到了人们的广泛关注，在生物应用领域也已经扩展到交联网络、生物传感以及功能化生物材料等方面。从合成的角度看，巯基-烯的反应有十分显著的优势，如反应速度快，应用范围广（不管反应物活性如何，大多数的烯烃和所有的巯基几乎都能满足反应条件），基本上属于最简便的一种无金属催化的点击化学反应。

2 巯基-烯点击反应的影响因素

2.1 巯基结构对反应速率的影响

参与巯基-烯点击反应的巯基化合物主要有4种，包括烷基硫醇酯类、烷基（芳基）硫醇类、烷基3-巯基酯类硫醇和烷基硫醇。在巯基-烯点击化学反应中，反应速率和巯基化合物的结构有关。含有推电子基团的巯基化合物的反应活性较高，如异丙撑基；含有吸电子基团的巯基化合物反应活性较低，如酯基。巯基-烯点击反应的巯基化合物的反应活性由小到大分别为硫苯酚类、烷基硫醇酯、烷基3-巯基酯类硫醇和烷基硫醇。

2.2 烯类单体结构对反应速率的影响

缺电子烯和富电子烯与巯基的反应是巯基-烯点击化学反应的主要两种类型。巯基与富电子烯之间反应迅速，如降冰片烯与巯基的反应速率很快。巯基与缺电子烯之间反应较慢，如马来酰亚胺、丙烯酸酯等。这是由于缺电子烯的双键需要被激活，所以需要弱碱性的催化剂催化才能进行，如三乙胺等亲核试剂。一般而言，巯基-烯点击反应的反应速率随着烯类单体碳碳双键电荷密度的下降而下降。

为了确定不同烯烃在巯基-烯点击反应中的速率，Cramer等［5］将硫醇和丙烯酸酯、丙烯基醚、乙烯基醚、降冰片烯和乙烯基氮烷分别与tetrathiola进行光聚合反应，结果如表1所示。从表中可以看出，降冰片烯的聚合速率最大，为6.0；其次是乙烯基醚，为4.8。在这两种反应中烯基官能团和巯基官能团对反应速率的贡献率相等。烯类单体反应速率的由小到大的顺序为：烯丙基醚、丙烯酸酯类、乙烯基硅氮烷、乙烯基醚和降冰片烯。

表1 不同烯烃与tetrathiola在巯基-烯点击反应中的最大速率Table 1 Maximum rates of different olefins in thiol-ene click reactions with tetrathiola

2.3 巯基和双键官能团的浓度

在巯基-烯点击反应的光聚合体系中，反应速率与巯基和烯基官能团的浓度呈一级反应。光聚合反应速率与链增长动力学常数（Kp）和链转移动力学常数（Kct）比值显著相关。在反应起始阶段，反应体系中存在着足量的巯基和烯基，二者的消耗速率相等。随着反应的进行，会出现3种不同的情况：当Kp≈Kct时，聚合反应的速率与巯基官能团和双键官能团的浓度都相关；当Kp＜＜Kct时，聚合反应的速率仅和双键的浓度呈一级反应；当Kp＞＞Kct时，聚合反应的速率仅和巯基的浓度呈一级反应［4］。

3 巯基-烯反应介导的生物标记技术

目前，巯基-烯点击反应已经应用于反应物官能化和聚合反应中，并且在生物分子的官能化方面已经有良好的应用。巯基-烯点击反应满足生物材料所要求的选择性、易于实施和高产率的特点，因此可以应用于生物材料的标记以实现生物分子功能化。虽然热敏自由基引发剂如偶氮二异丁腈已经被应用于在生物材料的功能化领域，但是在大规模合成时，受反应器设计和光衰减等因素的限制，升高反应温度才能更好的实现生物材料本体自由基均匀生成［6］。而巯基-烯点击反应在不需要升高温度的条件下，也可以容易地实现生物材料本体自由基均匀化和官能化。

3.1 巯基-烯反应在DNA分子标记中的应用

利用巯基-烯点击化学反应可以将官能化的DNA分子应用于DNA微流控芯片领域，以实现鉴定单碱基对错配等目的。利用巯基-烯点击反应可以将巯基修饰的DNA分子以共价键的方式固定到烯基修饰的硅基材料上，得到固定密度约6 pmol/cm2的DNA微阵列。整个反应过程不需要使用交联剂，并且具有直接连接、照射时间短（20 min）和杂交效率高（65%）的优点。得到的DNA微阵列可以对单碱基对错配进行鉴定［7］。另外，利用巯基-烯点击化学反应还可以将生物素探针固定于巯基化的硅表面。之后借助于链霉亲和素就可以实现生物素化DNA与硅基表面的组装，形成DNA微流控芯片。该方法获得的微流控芯片具有2 pmol/cm2的固定化密度和90%以上的杂交效率，性质优良［8］。巯基-烯点击反应还可以应用于制备特异性性检测沙门氏菌PCR产物的核酸微阵列。这种核酸微阵列由多巯基化的DNA与硅基材料通过巯基-烯点击化学反应制得，灵敏度达到20 μmol/L。并且这种硅基材料探针连接方式能够改善以核酸微阵列为基础的分析技术在重复性、可靠性和分析灵敏度方面的不足［9］。巯基-烯点击反应可以将巯基封端的邻苯二甲酸酯的核酸适配体结合到载体上，得到一种新型的基于适配体的邻苯二甲酸酯吸附剂。这种方法为特异性富集和高灵敏度检测邻苯二甲酸酯提供了新的方法，吸附回收率高达66.10%-108.90%［10］。除了硅基材料，利用巯基-烯点击反应还能将官能化的DNA引入金表面。巯基-烯点击化学反应可以将聚丁二烯的低聚物固定在α，ω-二硫醇巯基化的金表面上。之后再次通过巯基-点击化学反应使聚丁二烯残基与含巯基的化合物偶联，包括十八烷硫醇，1H、1H、2H、2H-全氟烷硫醇和巯基封端的25聚体 DNA［11］。另外，Wang等［12］利用巯基-烯点击反应可以将巯基化的凝血酶适配体固定在有机二氧化硅平台上，得到一种新型的核酸适体基有机硅杂化整体柱。这种亲和柱可以用来富集凝血酶，检测限为0.01 μmol/L，具有简单、快速和高效的特点。

3.2 巯基-烯反应在蛋白质标记中的应用

蛋白质在巯基或烯基的官能化后可以用来进行巯基-烯点击化学反应。对生物素或生物素蛋白进行烯丙基官能化之后，利用巯基-烯点击反应可以将蛋白质偶联到巯基化的表面上。蛋白质的偶联密度受暴露时间控制。并且蛋白质在与表面偶联后仍能保持活性［13］。Witrotk等［14］利用免疫相容的硫醚与牛血清白蛋白结合来制备与肿瘤相关的疫苗。巯基-烯点击化学反应可以将烯丙基官能化的牛血清白蛋白核心与巯基糖肽偶联，得到一种新的生物大分子。每个分子平均可以达到8个糖肽。

3.3 巯基-烯反应在其他化合物标记中的应用

化合物被巯基或烯基标记之后，不仅可以用来制备水凝胶、利用糖-蛋白质特异识别系统识别蛋白质，还可以被应用于生物医药中，如制备药物、递送药物等。

利用巯基-烯点击反应可以使巯基乙醇与核心为碳水化合物单体的树枝状大分子末端烯基发生连续的合成反应，得到的合成产物可以应用于细菌黏附［15］。这个反应过程的反应效率高达94%。Ortiz等［16］开发出一种利用巯基-烯点击反应快速制备水凝胶的新方法。在该方法中，利用巯基-烯点击反应可以在20 s 内完成硫醇单体与二烯醚基官能团化的水凝胶分子聚合，得到聚合网络。硫醇-烯点击化学反应和氮杂-迈克尔加成反应可以用于制备磺基甜菜碱官能化的聚缩醛树状大分子。这种生物大分子表现出pH响应药物释放行为，并且在负载了阿霉素后显示出显著的抗癌活性。这种制备方法不仅为聚缩醛树状聚合物的应用提供了新的思路，而且为开发具有临床应用潜力的抗癌纳米材料提供了参考［17］。碳水化合物被巯基或烯基标记之后，还可以用于识别特定蛋白。由于糖和蛋白质具有互补识别系统，利用巯基-烯点击化学反应可以将标记了巯基的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）与涂覆在石英表面的烯烃偶联，制备得到碳水化合物传感器。这种传感器可用于凝集素的检测，具有快速、有效和通量高的特点，并且可以检测未标记的蛋白质［18］。

利用巯基-烯点击化学反应可以构建具有药物递送功能的胶束结构。Chen等［19］利用巯基-烯点击反应将乙烯基的官能化的聚乙二醇-甲基丙烯酸酯与葡萄糖胺偶联，得到的产物为葡萄糖官能化的聚甲基丙烯酸2-羟乙酯。这种产物可以形成热可逆胶束，能够用于包封药物。巯基-烯点击化学反应可以用于高效生产具有抑制糖苷酶和抗H病毒活性的硫代二糖。通过巯基-烯点击化学反应可以将含巯基的糖分子和含烯基的糖分子进行偶联，得到硫代二糖。这种方法具有产率高、便捷，在硫代二糖的生产方面具有很大的应用优势［20］。

利用巯基-烯点击反应可以将含有喜树碱的甲硅烷基醚固定在介孔二氧化硅纳米颗粒上，得到喜树碱介孔二氧化硅纳米颗粒。在正常血浆条件下（pH7.4），喜树碱介孔二氧化硅纳米颗粒不会释放喜树碱；在体外酸性条件下（pH4.0），喜树碱会从介孔二氧化硅纳米颗粒中释放。这种功能化的纳米粒子具有药物控制释放的临床治疗潜力［21］。利用巯基-烯点击化学反应可以将C6位上烯基化的壳聚糖和巯基化的聚乙二醇交联，得到pH响应型壳聚糖水凝胶。这种水凝胶的溶胀和收缩可以有效调节阿霉素和牛血清白蛋白在不同pH介质中的相应释放行为。通过巯基-烯点击化学反应交联得到的壳聚糖水凝胶可能为药物靶向递送提供一种新的载体［22］。

4 巯基-烯点击反应在生物传感中的应用

随着巯基-烯反应应用范围的不断拓宽以及生物传感器在检测中的快速发展，巯基-烯反应介导的生物传感器逐渐增多，如荧光生物传感器、细胞传感器、电化学传感器等。可以实现miRNA、DNA、含有巯基的生物活性物质、整合素αvβ3过表达细胞、哺乳动物细胞、葡萄糖氧化酶、乳糖酶和凝集素等的检测。

4.1 荧光生物传感器

在荧光生物传感方面，巯基-烯点击反应发挥了重要的作用。Su等［23］通过在硅纳米颗粒表面结合DNA分子，构建了能够检测癌症相关基因miR-21的DNA共轭硅纳米粒子（SiNPs）。巯基官能化DNA通过与烯烃接枝的SiNP发生巯基-烯点击化学反应，生成SiNP-DNA缀合物。当没有靶标miR-21时，荧光基团和淬灭基团的距离很近，整个反应体系处于荧光淬灭的状态，不显现荧光；当靶标miR-21出现时，miR-21可以与DNA的一条链发生链置换反应，荧光基团和淬灭基团发生分离，显现荧光。因此可以通过是否显示荧光来判断癌症相关基因miR-21是否存在。这种方法不仅反应条件温和，而且具有良好的特异性，可以应用于癌症的治疗和诊断。有学者报道了一种通过在硅表面上使用固定化分子信标来检测DNA的方法。巯基-烯点击化学反应可以将荧光标记的探针连接到硅基表面。锚定的分子信标能够以微阵列形式高选择性和灵敏度的与互补靶标杂交，检测限为（9.9 ± 1.1）nmol/L［24］。利用巯基-稀点击反应制作的合成纸产生的荧光信号能够用于检测全脂牛奶中的抗生素恩诺沙星。合成纸的检测限为1.64 nmol/L，低于玻璃和硝化纤维素基质［25］。Rong等［26］设计了一种基于谷胱甘肽调制的开启荧光策略的开启式上转换荧光传感器，用于快速检测丙烯酰胺。首先通过水热法制备了聚乙烯亚胺改性的上转换纳米颗粒，然后通过非共价键合将罗丹明B衍生物负载在其表面上。谷胱甘肽与罗丹明B衍生物耦合后，通过荧光共振能量转移强烈淬灭上转换荧光。加入三（2-羧乙基）膦后，有效催化了谷胱甘肽和丙烯酰胺之间的巯基-烯迈克尔加成反应，触发被淬灭的荧光。利用巯基-烯点击化学反应和叶酸改性制备的C60荧光纳米颗粒可以灵敏且特异性的检测叶酸。并且这种C60荧光纳米颗粒易于进入叶酸受体表达水平更高的癌细胞，从而识别靶标细胞并对靶标细胞成像［27］。利用马来酰亚胺将四苯基乙烯官能化后，可以得到马来酰亚胺-四苯基乙烯复合物。当含有巯基的生物活性物质存在时，马来酰亚胺-四苯基乙烯复合物中的马来酰亚胺侧链会和巯基发生巯基-烯点击化学反应。得到的产物具有聚集诱导发射性质，会产生荧光。这种方法的检测限低至1 ppb，并且产生的信号易于观察。另外，所制备的马来酰亚胺-四苯基乙烯复合物还可作为可视化试剂对活细胞进行染色。这种方法制备的细胞荧光图像可用来描绘细胞中巯基物质分布［28］。

4.2 细胞传感器

巯基-烯点击反应还被应用于细胞传感器。巯基-烯点击反应可以用于检测特异蛋白过表达的细胞。利用CuAAC和巯基-烯双点击的方法可以制备的N-乙酰基-1-半胱氨酸-聚甲基丙烯酸甲酯-b-聚己内酯嵌段共聚物（N-Acetyl-l-cysteine-capped poly（methyl methacrylate）-b-polycaprolactone block copolymer，PMMA-b-PCL-NAC）可以作为生物分子结合的固定基质。通过共价结合的方式可以将精氨酸甘氨酸天冬氨酸（arginine（R），glycine（G），and aspartic acid（D），RGD）肽序列固定到PMMA-b-PCL-NAC的表面上，形成PMMA-b-PCL-NAC-RGD平台。之后可通过光学特异性和电化学转导监测整合素αvβ3过表达的细胞［29］。巯基-烯点击化学反应可以将巯基化透明质酸/巯基化明胶的巯基基团与聚乙二醇-降冰片烯分子的烯基快速偶联，得到透明质酸/明胶水凝胶。利用分子印刷仪器能够直接印刷和控制水凝胶基质内活细胞的固化，实现微米级哺乳动物细胞印刷，制备微米级细胞图案［30］。

4.3 电化学传感器

巯基-烯点击反应在电化学传感器中也具有很好的应用前景。例如，利用巯基-烯点击反应可以将石墨烯（graphene，GR）与半胱胺盐酸盐（HS-（CH2）2-NH2·HCl）结合，得到功能化的石墨烯表面。石墨烯表面的N原子能吸附并稳定金纳米颗粒（Au nanoparticles，AuNP）， 形 成 GR-Cys-AuNPs复合物。将获得的GR-Cys-AuNPs复合物沉积在玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上，通过电化学的方法可以确定确定样品中尿酸（uric acid，UA）和叶酸（folic acid，FA）的含量（图2）［31］。Zeng等［32］利用巯基-烯基点击化学反应将含有烯基的Ru（bpy′）3Cl2衍生物和含有巯基的3-巯丙基三甲氧基硅烷进行偶联，将Ru（bpy′）3Cl2衍生物固定在3-巯丙基三甲氧基硅烷预处理的氧化铟锡基底上，制备了固态电化学发光传感器。使用三正丙胺作为模型分析物时，这种电化学传感器的线性范围在（5×10-6-5×10-3）mol/L之间，检测限为1×10-6mol/L。这种固定化方法简单、快速、高效。并且所得到的 Ru（bpy′）32+单层膜在有机溶剂中表现出极好的稳定性。

图2 GR-Cys-AuNPs纳米复合传感器的制备示意图［31］Fig. 2 Schematic diagram of the fabrication of GR-Cys-AuNPs nanocomposite sensor［31］

4.4 其他类型传感器

利用巯基-烯点击化学反应可以将聚乙烯亚胺修饰在负载表面上，得到的多胺表面具有高的表面氨基浓度和链霉抗生物素蛋白负载能力。这种方法在氨基酸和蛋白质传感方面有很大的优势［33］。利用巯基-烯点击反应可以将聚乙二醇、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽和精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸肽引入到烯烃修饰的底物上。这种方法可以很好地用在内皮细胞的高通量筛选中［34］。通过使用巯基-烯点击化学反应，还可以在负载表面上快速、简便、易行的固定酶。具体方法在玻璃表面上生成烯烃封端的自组装单层膜，之后通过巯基-烯点击化学反应，使得酶的游离巯基和基质上的烯烃之间形成共价键，从而可以实现酶的固定。利用这种方法固定的酶不会失去原有的活性，如葡萄糖氧化酶和乳糖酶被固定之后仍然具有活性。这种方法在表面上缀合酶传感器阵列方面具有很大的应用潜力［35］。

巯基-烯点击化学反应在碳水化合物传感器中也有应用。在石英表面先进行烯烃/炔烃的涂覆，随后利用巯基-烯和巯基-炔点击化学反应使得含有烯烃/炔烃的表面与能够和凝集素特异性结合的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）直接在一滴水中进行反应，实现蛋白质的特异性检测。这种方法具有高速、有效、通量高的特点，且对未标记的蛋白质也可以进行检测［18］。

5 巯基-烯点击反应在细胞成像中的应用

生物成像可以用于详细了解细胞过程和疾病机制。巯基-烯点击反应作为无金属参与的点击反应，在反应动力学、反应物毒性以及生物利用度等属性上都十分适用于生物分子在细胞及体内的成像，有助于人们更好地了解生物分子参与的生物过程以及在生物体系中的发挥的作用。细胞成像一般需要发生肽或蛋白质特异性反应，才能实现细胞的图案化。利用巯基-烯点击反应可以将烯基官能化（烯丙基和降冰片烯残基）防污聚合物刷与细胞黏附肽RGD和精氨酸谷氨酸天冬氨酸缬氨酸偶联后，可以观察聚合物刷对脐静脉内皮细胞的黏附作用。另外，为了实现良好的细胞成像功能，可以在聚合物刷子的表面连接上光致发光肽，通过荧光显微镜和原子力显微镜能够观察到细胞微阵列［36］。含有烯基的四苯乙烯-马来酰亚胺加合物是一种巯基特异性生物探针。当这种生物探针暴露于含有巯基的L-半胱氨酸时，通过巯基-烯点击化学反应，可以产生易于观察的荧光。因此可以利用四苯乙烯-马来酰亚胺加合物作为可视化试剂对活细胞进行标记，得到清晰的荧光图像。这为描绘细胞中含有巯基的化合物的分布提供了一个简便、特异、灵敏的荧光标记方法［28］。利用硫醇-烯点击化学反应可以将含有巯基的聚乙二醇有效地引入非荧光纳米金刚石中，得到聚乙二醇化的荧光纳米金刚石。这种复合材料显示出高的水分散性、强的荧光性和低的细胞毒性，并具有良好的细胞染色性能，在生物成像方面显示出巨大潜力［37］。

6 巯基-烯点击反应在纳米材料的生物功能化中的应用

随着新型材料的特性不断被发掘，纳米材料作为其中一员，因其结构庞大，负载能力高以及独特且可调控的物理和化学性质成为药物递送系统开发中的重要工具。巯基-烯点击反应介导的纳米材料药物递送技术也得到一定程度的发展。巯基烯点击化学反应可以将具有巯基的各种化合物缀合到烯基官能化的硅纳米颗粒的表面，而不影响硅纳米颗粒的特征荧光性质［38］。硫醇-烯烃点击化学反应可以在大气环境下功能化硅表面而不引入氧化硅，否则会对电子性能产生不利影响。有的研究学者在非常温和的条件下利用巯基-烯点击化学的方法将各种功能分子连接到无氧化物的Si（111）表面上，而不引入氧化硅。这种方法具有通用、有效、简便的和可模式化等特点，为生物功能电子学提供了新的途径［39］。利用巯基-烯点击化学可以将含有巯基的酶缀合到烯基官能化的硅纳米晶体表面，得到得到生物无机杂化物。这种杂化物在缓冲液中分散性好、光稳定性强，并且具有光致发光和催化活性，在硝基苯酯和尿素的化学检测中具有潜在的应用［40］。磁性纳米颗粒与生物分子结合是一个很有前景的研究领域。利用巯基-烯点击化学方法可以将纳米磁性颗粒胺基原位官能化，可以得到能够结合抗Englrailed-2蛋白的抗体的功能化磁性纳米颗粒。共价键合法的固定效率比物理吸附法高（1.775 mg/g vs 0.54 mg/g）［41］。在微乳液中以肌红蛋白为模版，利用硫醇-烯点击化学反应制备的分子印迹纳米颗粒能够选择性的识别肌红蛋白［42］。

7 展望

巯基-烯点击化学反应因其简便性受到了科研工作者的青睐。巯基-烯点击反应的操作性强，产率和转化率高，反应速度快等优势，使其在聚合物科学和分子合成方面具有很大的潜力。然而巯基-烯点击反应在生物传感领域的应用仍有一些不足之处：（1）目前合成含有双键的单体或聚合物的方法已经比较成熟，且得到的化合物种类丰富。而含有巯基的化合物的合成过程复杂，并且巯基化合物结构种类不足。这不利于了巯基-烯点击化学反应在生物传感领域扩大应用范围。因此，探索合成不同种类和官能度的巯基化合物是之后的研究重点之一。（2）对生物分子不同位置进行官能团标记的成本较高也限制了巯基-烯点击反应在生物传感领域的广泛应用。（3）目前巯基-烯点击化学反应主要集中于检测小分子和核酸的荧光传感器，导致传感器的种类缺乏多样性。因此，将巯基-烯点击化学反应更多的应用于其他类型生物传感器是值得研究的方向，如光谱生物传感器、可视显色传感器、仿生传感器等。这将有助于拓宽巯基-烯点击反应的应用范围。（4）目前巯基-烯点击反应的研究仍处于实验室研究阶段，还未在生物传感领域达到大规模化应用的阶段。利用巯基-烯点击反应搭载重现性好、灵敏、准确的生物传感器是实现商业化和规模化生产的基础。另外，基于巯基-烯点击化学反应被较多的应用于合成生物聚合物、功能化纳米颗粒，以及检测多种生物分子等方面，巯基-烯点击化学反应具有应用于化学和生物学前沿领域的巨大潜力。巯基-烯点击化学反应还有可能更加深入的扩展到材料科学领域，广泛用于合成或功能化聚合物，并在涉及特殊性能材料的学科中具有广阔的应用前景。