成伟华，牛聪，孙强稳，陈虹，邹忠梅

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；2.原子高科股份有限公司，北京102413；3.武警总医院医务部，北京100039；4.武警8720部队医院药械科，无锡214000；5.武警后勤学院生药学教研室，天津300309）

论著

呋喃鬼臼毒素衍生物及其抗肿瘤活性研究

成伟华1，2，牛聪3，孙强稳4，陈虹5，邹忠梅2

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；2.原子高科股份有限公司，北京102413；3.武警总医院医务部，北京100039；4.武警8720部队医院药械科，无锡214000；5.武警后勤学院生药学教研室，天津300309）

目的：获得抗肿瘤活性更强的鬼臼毒素衍生物。方法：以鬼臼毒素为起始原料，通过把取代呋喃和鬼臼毒素拼接，设计并合成5个4β-N-取代呋喃鬼臼毒素衍生物，目标产物的结构通过1H-NMR，13C-NMR和HRMS的确证，同时采用MTT法评价新化合物对HeLa，K562和K562/A02的细胞毒活性。结果：合成的5个化合物均具有确切的细胞毒活性，其中化合物7c和11b对于耐药肿瘤细胞K562/A02的活性明显优于阳性对照依托伯苷。结论：把取代呋喃连接到鬼臼毒素可以增加抗肿瘤活性。

鬼臼毒素；结构修饰；抗肿瘤活性.

癌症严重威胁人类的健康和生命，已成为人类第一位的致死性病因，现有的肿瘤化学治疗药物存在疗效低、毒性大、难于吸收、价格昂贵及易于产生耐药性等缺点，因此，全球每年投入大量的人力及物力寻找和开发防治癌症的新药［1］。鬼臼毒素是从鬼臼属（Dysosma）植物中分离得到的具有显著抗肿瘤活性的芳基四氢萘类木脂素内酯。由于鬼臼毒素的毒性较大在应用上受到很大的限制，此后经过结构修饰合成得到鬼臼毒素衍生物依托泊苷（VP-16）和替尼泊苷（VM-26），并成为抗肿瘤临床药物［2］。但它们在实际临床使用中却常常受到限制，其中最主要的问题是水溶性差和存在骨髓抑制等毒副作用［3-4］。构效关系研究表明保留反式内酯环的基础上，C-4位是比较有效的修饰位点，C-4位可以通过氧、硫、氮原子来连接。一般而言，以氮原子连接的衍生物的活性都比较好，而4β-氮取代鬼臼毒素衍生物对多种人类癌细胞株显示出比VP-16还要高的抗癌活性［5-7］。为进一步寻找更为高效和低毒的抗肿瘤新药，本研究分析鬼臼毒素类化合物构效关系，在保留C-4位取代基的β构型及内酯环的反式取向的基础上，集中在C-4位上设计合成了一系列4β-氮取代鬼臼毒素衍生物，其结构经1H-NMR，13C-NMR和HRMS的确证，并经MTT法筛选了该类衍生物的体外抗肿瘤和抗多药耐药活性。

1　仪器与方法

1.1仪器与试剂熔点测定仪：Fisher-Johns熔点仪（温度计未校正）。核磁共振光谱用BRUKERBRUKER ARX-600型核磁仪测定，采用CDCl3为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标，偶合常数（J）以赫兹（Hz）为记录单位。高分辨质（HR-ESI-MS）在Quattro MicroTM API（Waters，Milford，MA）质谱仪上测定，比旋光度在Perkin-Elmer 241 MC旋光仪上于室温（25℃）测定，光源选择钠灯D线。薄层色谱（TLC）（GF254，0.5 mm，青岛产），柱层色谱硅胶：60-100目，100-200目，200-300目均为青岛海洋化工厂产品，薄层层析硅胶：GF 254（青岛海洋化工厂）。MQX-200酶标仪：Bio-Tek.Instruments Inc.，USA。鬼臼毒素（98%）购自南京青泽医药科技开发有限公司。若无特殊说明，实验试剂均为市售化学纯或分析纯，未经说明没有另外纯化。

1.2合成路线本路线采用糠醇为起始原料，首先在冰醋酸条件下与R2NR3发生Mannich反应生成N-取代呋喃中间体，然后经过氧化生成N-取代呋喃甲醛中间体3a-3c（图1），该中间体在常温条件下与4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素或4β-氨基-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素发生反应后，再经还原反应生成目标化合物7a-7c和11a-11b（图2）。

图1　化合物3a-3c的合成路线Fig 1 Synthesis of com pound 3a-3c

图2　化合物7a-7c， 11a-11b的合成路线Fig 2 Synthesis of com pound 7a-7c， 11a-11b

合成中间体4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素采用在三氟乙酸条件下，鬼臼毒素与叠氮化钠发生取代反应制得中间体4β-叠氮基-4-脱氧表鬼臼毒素，中间体4β-叠氮基-4-脱氧表鬼臼毒素在10%Pd/C催化下被甲酸铵还原为4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素［8-9］。

1.3合成实验

1.3.1鬼臼毒素类衍生物中间体的合成

1.3.1.1 4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素10的合成：将鬼臼毒素8（4.14 g，10 mmol）溶于50 mL干燥二氯甲烷中，小心加入NaN3（2.60 g，40 mmol）搅拌使其溶解，0℃下将10 mL CF3COOH缓慢滴加到反应液中，反应1 h后，室温反应4 h。TLC检测反应完成，0℃下，滴入NaHCO3饱和溶液至无气泡为止，分出有机层，无水Na2SO4干燥，减压蒸干，粗品用二氯甲烷：乙酸乙酯（1∶1）重结晶，得白色晶体4β-叠氮-4-脱氧表鬼臼毒素9 3.99 g，收率89%。将4β-叠氮-4-脱氧表鬼臼毒素9（4.39 g，10 mmol）溶于50 mL乙酸乙酯中，加入10%Pd/C（1.00 g），HCOONH4（2.52 g，40 mmol），加热回流搅拌5 h，TLC检测反应完全，过滤回收Pd/C，滤液用饱和食盐水洗3遍，减压蒸干得白色泡沫状固体粗产物4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素10 3.63 g，收率88%，不经进一步分离纯化可直接用于下一步反应［10］。

1.3.1.2 4β-氨基-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素6的合成：将4′-去甲基鬼臼毒素4（4.00 g，10 mmol）溶于50 mL干燥二氯甲烷中，小心加入NaN3（2.60 g，40 mmol）搅拌使其溶解，0℃下将10 mL CF3COOH缓慢滴加到反应液中，反应1 h，室温反应4 h。TLC检测反应完成，0℃下，滴入NaHCO3饱和溶液至无气泡为止，分出有机层，无水Na2SO4干燥，减压蒸干，粗品用二氯甲烷：乙酸乙酯（1∶1）重结晶，得白色晶体4β-叠氮-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素5 3.82 g，收率90%。将4β-叠氮-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素5（4.25 g，10 mmol）溶于50 mL乙酸乙酯中，加入10%Pd/C（1.00 g），HCOONH4（2.52 g，40 mmol），加热回流搅拌5 h，TLC检测反应完全，过滤回收Pd/C，滤液用饱和食盐水洗3遍，减压蒸干得白色泡沫状固体粗产物4β-氨基-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素6 3.63 g，收率88%，不经进一步分离纯化可直接用于下一步反应［10］。

1.3.2中间体3a-3c的合成将1 mmol糠醇1、1.2 mmol不同的二级胺和1.5 mmol甲醛水溶液溶于15 mL冰醋酸中，40℃反应2～4 h，TLC检测反应完全，减压尽量回收冰醋酸，然后用饱和NaOH溶液调节pH值为10-11，用乙酸乙酯萃取3次（3×30 mL），无水Na2SO4干燥，减压旋干后，溶于10 mL干燥CH2Cl2中，加入10 mmol活性MnO2室温反应2 h，减压旋干后，柱层析得到N-取代呋喃甲醛中间体3a-3c。

1.3.3目标化合物7a-7c的合成将0.6 mmol取代呋喃甲醛中间体3a-3c、4β-氨基-4′-去甲基-4-脱氧表鬼臼毒素6（0.5 mmol）溶于10 mL无水甲醇中，加入3滴冰乙酸做为催化剂，室温搅拌反应4～8 h，TLC检测反应完全。将反应液温度降至0℃，加入3 mmol NaBH4。加入完毕后，补加适量无水甲醇，0℃搅拌反应3～6 h，直至原料全部反应完毕（TLC检测）。滴加5%稀盐酸调节pH至7.5，减压旋干，加入20 mL蒸馏水超声使其呈混悬状态，加入等体积二氯甲烷萃取，有机相无水Na2SO4干燥，减压旋干得到粗品，粗品经柱层析（二氯甲烷：甲醇）纯化得到目标产物7a-7c，收率58%～75%。

1.3.4目标化合物11a和11b的合成将0.6 mmol取代呋喃甲醛中间体3a和3c、4β-氨基-4-脱氧表鬼臼毒素10（0.5 mmol）溶于10 mL无水甲醇中，加入3滴冰乙酸做为催化剂，室温搅拌反应4～8 h，TLC检测反应完全。将反应液温度降至0℃，加入3 mmol NaBH4。加入完毕后，补加适量无水甲醇，0℃搅拌反应3～6 h，直至原料全部反应完毕（TLC检测）。滴加5%稀盐酸调节pH至7.5，减压旋干，加入20 mL蒸馏水超声使其呈混悬状态，加入等体积二氯甲烷萃取，有机相无水Na2SO4干燥，减压旋干得到粗品，粗品经柱层析（二氯甲烷∶甲醇）纯化得到目标产物11a-11b，收率69%～71%。

1.4 MTT法检测体外抗肿瘤活性对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100 μL（含5 000～6 000个肿瘤细胞），置37℃，5%CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的化合物，每种细胞设4～5个剂量组，每组至少设3个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃，5%CO2温箱中培养。48 h后弃培养液，每孔加20μL 5 mg/mL MTT溶液（培养基配制）。37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪在参考波长450 nm、检测波长570 nm条件下测定光密度值（OD），以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过Logit方法计算得到半数抑制浓度（I C50），重复测试3次，取平均值为最终结果［11］。

2　结果

2.1化合物的表征数据

7a：白色固体，收率：68%，mp：218-219℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ 6.45（s，1H，5-H），6.34（s，1H，8-H），6.27（s，2H，2′，6′-H），6.23（d，J=3.1 Hz，1H，4-Furan-H），6.21（d，J=3.1 Hz，1H，3-Furan-H），5.93（d，J=1.4 Hz，1H，α-OCH2O），5.91（d，J=1.4 Hz，1H，β-OCH2O），4.51（d，J=5.2 Hz，1H，1-H），4.32-4.19（m，2H，11-CH2-），3.91（d，J=3.9 Hz，1H，4-H），3.89（d，J=15.0 Hz，1H，α-CH2-Morpholine），3.76-3.73（m，4H，3，5-Morpholine-H），3.74（s，6H，3′，5′-OCH3），3.60（d，J=15.0 Hz，1H，β-CH2-Morpholine），3.57（d，J=1.9 Hz，2H，-CH2-Furan-），3.30（dd，J=13.8，5.3 Hz，1H，2-H），2.79-2.70（m，1H，3-H），2.55-2.49（m，4H，2，6-Morpholine-H）.13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ 175.51，153.36，147.63，147.25，146.39，133.99，132.38，131.82，131.13，110.09，108.54，108.37，108.00，101.29，68.45，66.73，56.43，55.44，54.63，53.36，46.61，43.52，41.36，38.62.HR-ESI-MS m/z：579.2352［M+H］+，理论值：579.2343［M+H］+。

7b：白色固体，收率：75%，mp：212-223℃；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ 7.31-7.27（m，2H，3，5-ArH），6.95（d，J=8.0 Hz，2H，2，6-ArH），6.89（t，J= 7.3 Hz，1H，4-ArH），6.48（s，1H，5-H），6.39（s，1H，8-H），6.31（s，1H，4-Furan-H），6.29（s，2H，2′，6′-H），6.25（d，J=3.0 Hz，1H，3-Furan-H），5.91（d，J=1.4 Hz，2H，-OCH2O），4.55（d，J=5.2 Hz，1H，1-H），4.35-4.25（m，2H，11-CH2-），3.95（d，J=3.8 Hz，1H，4-H），3.94（d，J=15.0 Hz，1H，α-CH2-Piperazine），3.78（s，6H，3′，5′-OCH3），3.70（s，2H，-CH2-Furan-），3.66（d，J =15.0 Hz，1H，β-CH2-Piperazine），3.34（dd，J=13.8，5.2 Hz，1H，2-H），3.32-3.26（m，4H，3，5-Piperazine-H），2.83-2.78（m，1H，3-H），2.78-2.68（m，4H，2，6-Piperazine-H）.13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ 175.46，151.09，149.60，147.65，147.24，146.39，146.30，133.93，132.32，131.82，131.14，129.12，129.10，119.90，116.17，116.14，110.11，108.62，108.35，108.03，107.97，101.25，68.43，68.01，67.60，56.48，56.44，54.72，52.74，48.77，46.64，43.52，41.35，38.61.HR-ESI-MS m/z：654.2818［M+H］+，理论值：654.2815［M+H］+。

7c：黄色固体，收率：58%，mp：218-219℃；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ 8.15（d，J=9.4 Hz，2H，3，5-ArH），6.85（d，J=9.4 Hz，2H，2，6-ArH），6.49（s，1H，5-H），6.44（s，1H，8-H），6.31（s，1H，4-Furan-H），6.30（s，2H，2′，6′-H），6.26（s，1H，3-Furan-H），5.93 -5.91（m，2H，-OCH2O），4.54（d，J=5.2 Hz，1H，1-H），4.34-4.22（m，2H，11-CH2-），3.95（d，J=3.8 Hz，1H，4-H），3.92（d，J=15.0 Hz，1H，α-CH2-Piperazine），3.79（s，6H，3′，5′-OCH3），3.72（d，J=15.0 Hz，1H，β-CH2-Piperazine），3.70-3.60（d，J=1.9 Hz，2H，-CH2-Furan），3.56-3.45（m，4H，3，5-Piperazine-H），3.33（dd，J=13.8，5.2 Hz，1H，2-H），2.83-2.76（m，1H，3-H），2.77-2.63（m，4H，2，6-Piperazine-H）.13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ 175.20，152.56，149.39，148.01，147.26，137.21，135.75，132.14，129.55，125.91，115.55，112.79，110.53，108.81，108.39，101.43，67.97，67.61，60.75，56.29，52.29，46.92， 44.09，41.44，37.69.HR-ESI-MS m/z：699.4907［M+ H］+，理论值：699.2666［M+H］+。

11a：白色固体，收率：69%，mp：219-220℃；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ 6.48（s，1H，5-H），6.37（s，1H，8-H），6.28（s，2H，2′，6′-H），6.27（s，1H，4-Furan-H），6.23（d，J=3.0 Hz，1H，3-Furan-H），5.96（d，J=1.3 Hz，1H，α-OCH2O），5.95（d，J=1.3 Hz，1H，β-OCH2O），4.55（d，J=5.3 Hz，1H，，1-H），4.35-4.24（m，2H，11-CH2-），3.94（d，J=3.4 Hz，1H，4-H），3.92（d，J=15.0 Hz，1H，α-CH2-Morpholine），3.80-3.75（m，4H，3，5-Morpholine-H），3.78（s，3H，4'-OCH3），3.76（s，6H，3′，5′-OCH3），3.66（d，J=15.0 Hz，1H，β-CH2-Morpholine），3.61（s，2H，-CH2-Furan-），3.35（dd，J=13.8，5.3 Hz，1H，2-H），2.83-2.75（m，1H，3-H），2.64-2.48（m，4H，2，6-Morpholine-H）.13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ 175.38，152.44，147.64，147.28，137.09，135.63，132.33，131.63，110.10，108.56，108.35，108.30，101.29，68.41，66.61，60.72，56.22，54.67，53.26，46.62，43.67，41.24，38.66.HRESI-MS m/z：593.2569［M+H］+，理论值：593.2499［M+H］+。

11b：黄色固体，收率：71%，mp：221-223℃；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ 8.13-8.09（m，2H，3，5-ArH），6.82-6.79（m，2H，2，6-ArH），6.45（s，1H，5-H），6.40（s，1H，8-H），6.25（s，2H，2′，6′-H），6.24（s，1H，4-Furan-H），6.21（d，J=3.0 Hz，1H，3-Furan-H），5.88（s，2H，-OCH2O），4.52（d，J=5.3 Hz，1H，1-H），4.31-4.21（m，2H，11-CH2-），3.91（d，J=3.9 Hz，1H，4-H），3.89（d，J=15.0 Hz，1H，α-CH2-Piperazine），3.79（s，3H，4′-OCH3），3.72（s，6H，3′，5′-OCH3），3.68（d，J=15.0 Hz，1H，β-CH2-Piperazine），3.64（s，2H，-CH2-Furan-），3.46（q，J=5.9，5.4 Hz，4H，3，5-Piperazine-H），3.31（dd，J=13.8，5.3 Hz，1H，2-H），2.80-2.73（m，1H，3-H），2.70-2.60（m，4H，2，6-Piperazine-H）.13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ 175.35，154.75，152.47，147.66，147.28，135.58，132.35，131.72，125.91，112.65，110.18，108.58，108.41，108.32，101.26，68.41，60.72，56.28，54.88，52.29，46.84，46.72，43.68，41.25，38.67.HR-ESI-MS m/z：713.2826［M+H］+，理论值：713.2823［M+H］+。

2.2细胞毒性测定测试5个新的鬼臼毒素衍生物的细胞毒活性（表1）。结果显示所合成的5个新化合物都具有细胞毒活性，其中化合物7c和11b对于耐药肿瘤细胞K562/A02的活性明显优于阳性对照依托伯苷。

表1　目标化合物对HeLa，K 562和K 562/A02细胞增殖的抑制活性（±s±s，n=3）Tab 1 Inhibiting activity of target com pounds against HeLa，K562and K 562/A02 proliferation（±s±s，n=3）

表1　目标化合物对HeLa，K 562和K 562/A02细胞增殖的抑制活性（±s±s，n=3）Tab 1 Inhibiting activity of target com pounds against HeLa，K562and K 562/A02 proliferation（±s±s，n=3）

IC50/（μmol/L）Com. 7a 7b 7c 11a 11b VP-16 R1 -H -H -H -CH3-CH3R2K562＞100 45.46±2.06 7.01±1.01 13.24±1.21 8.99±0.99 3.39±0.45 K562/A02＞1 000 157.29±5.23 29.40±3.21 109.36±5.55 21.12±1.51 234.7±6.67 HeLa 1.01±0.21 18.98±0.98 1.02±0.25 8.34±0.77 8.34±0.82 6.27±0.62

3　讨论

以天然产物鬼臼毒素结构为基础，设计并合成了5个未见文献报道的4β-N-取代呋喃鬼臼毒素衍生物，化合物结构经1H-NMR和13C-NMR和HRESI-MS确证，以依托泊苷为阳性对照，MTT法测试了所合成的5个4β-N-取代呋喃鬼臼毒素衍生物对HeLa，K562和K562/A02肿瘤细胞的细胞毒活性，结果表明，与阳性对照VP-16相比，所合成化合物细胞毒活性均较强，其中末端取代基为NO2的化合物，对于耐药的K562/A02细胞具有较强的活性，值得进一步研究。

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（2016-03-01收稿）

Synthesis and evaluation of furanoid podophyllotoxin derivatives w ith anticancer activity

CHENG Wei-hua1，2，NIU Cong3，SUN Qiang-wen4，CHEN Hong5，ZOU Zhong-mei2
（1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Atom High Tech Co.LTD.，Beijing 102413，China；3.General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China；4.8720 Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Wuxi 214000，China；5.Pharmacognosy Division，Medical College of Chinese People's Armed Police Force，Tianjin 300162，China）

O bjective：To acquire novel podophyllotoxin derivatives with higher antitumor activity.M ethods：The podophyllotoxin derivatives were synthesized using podophyllotoxin as the starting material through substituted furfuran and success split joint podophyllotoxin.Five 4β-N-substituted furfuran podophyllotoxin derivatives were designed，synthesized，and confirmed by1H-NMR，13C-NMR and HRMS，In vitro，cytotoxieities were tested against three human tumor cells（HeLa，K562，K562/A02）by MTT.Results：All compounds showed improved activities against HeLa and K562 when compared with VP-16.In particular，compound 7c，11b exhibited the most potent activity toward drug-resistant K562/A02 cells，as compared to VP-16.Conclusion：Substituted furan connected to the podophyllotoxin could increase antitumor activity.

podophyllotoxin；structure modification；antitumor activity.

R9

A

1006-8147（2016）05-0381-05

国家自然科学基金资助项目（30873363）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09307-002-01 、2013ZX09508104）

成伟华（1985-），男，助理研究员，博士，研究方向：天然产物结构修饰及放射性药物研究；通信作者：邹忠梅，E-mail：zm zou@implad. ac.cn。