李晶鑫，许芳秀，2，王玉，郭燕，3，钱碧云，4

（1.天津医科大学肿瘤医院肿瘤流行病与生物统计室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津300060；2.解放军第401医院药剂科，青岛266071；3.天津医科大学肿瘤医院病理科，天津300060；4.上海交通大学公共卫生学院，上海200025）

NFAT2在非小细胞肺癌中的表达及预后关联研究

李晶鑫1，许芳秀1，2，王玉1，郭燕1，3，钱碧云1，4

（1.天津医科大学肿瘤医院肿瘤流行病与生物统计室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津300060；2.解放军第401医院药剂科，青岛266071；3.天津医科大学肿瘤医院病理科，天津300060；4.上海交通大学公共卫生学院，上海200025）

目的：研究NFAT2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况及与患者生存预后的关系。方法：收集原发性NSCLC肿瘤组织315例及其配对的正常组织164例，免疫组织化学染色检测NFAT2蛋白表达情况，同时进行临床关联及预后分析。结果：NFAT2在NSCLC中高表达（P＜0.001）。在女性及非吸烟早期NSCLC中，NFAT2表达上调与生存期缩短相关，差异具有统计学意义（P=0.003、P=0.001）。结论：NFAT2是NSCLC发生的危险因子，NFAT2高表达可能预示着不良预后结局。

NFAT2；非小细胞肺癌；免疫组织化学技术

肺癌是目前发病率、死亡率都位居首位的恶性肿瘤，其中85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。2012年在亚洲国家中，肺癌新发病例为1 033 881例，其中71.13%为男性，28.87%为女性；肺癌死亡病例数为936 051例，其中71.45%为男性，28.55%为女性。无论在男性或者女性中，肺癌的发病率和死亡率都居高不下［1］。尽管目前放化疗技术在肿瘤中得到广泛应用，但NSCLC的治疗仍以手术切除为主［2］。大多肺癌患者出现明显临床症状时已为晚期，错过了最佳的手术治疗时机，影响预后生存状况。因此识别NSCLC早期诊断和治疗的标志物，可以早期发现并介入治疗，有效改善肺癌患者的生存率。活化T细胞核转录因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是一类转录因子家族，包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4、NFAT5。该家族中各个亚型在组织中均存在广泛表达［3］。现研究证明，NFAT家族在肿瘤中发挥着重要作用，能够调控细胞周期，影响细胞增殖、细胞凋亡、侵袭能力，在多种肿瘤中发挥促癌基因或者抑癌基因的作用［4］。NFAT2又称NFATC1，是NFAT家族中的一个重要因子。本文拟研究NFAT2在NSCLC中的表达情况，探讨NFAT2表达对NSCLC的影响及与预后关联，以期识别NSCLC早期诊断的标志物。

1　对象与方法

1.1研究对象本研究所需的病例均来自天津医科大学肿瘤医院，于2007-2011年收治入院并进行手术切除治疗的原发性非小细胞肺癌患者。所有病例均经病理确诊。纳入研究的NSCLC患者肿瘤组织315例及其配对的癌旁组织164例，均经石蜡包埋制作成组织芯片（tissue microarray，TMA）。从诊断之日起对纳入研究的NSCLC患者进行随访，随访截止时间为2013年8月，或者出现因肿瘤引起的死亡结局。

1.2研究方法采用免疫组织化学技术进行组织染色。将组织芯片置于60℃烤箱中烘烤1 h进行脱蜡，然后依次通过二甲苯60 min、无水乙醇10 min、95%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min进行水化。PBS冲洗3次，枸橼酸钠缓冲液作为修复液高压修复2 min后冷却至室温。置于过氧化氢溶液中避光放置30 min，以除去内源性过氧化物酶。平放于湿盒中滴加一抗，4℃孵育过夜。次日将组织芯片复温后滴加二抗，室温孵育1 h，PBS冲洗3次。DAB显色5～7 min后将组织芯片放入自来水中终止显色反应。苏木染色5 min，分化液分化，再依次逆序通过梯度酒精及二甲苯进行脱水。封片，在室温下晾置后阅片。

1.3结果判读组织芯片染色结果由两名病理科医生分别阅片，意见不一致时，由第三名医生进行复读。阳性细胞染色强度以0分、1分、2分、3分四个等级分别表示未着色、浅棕色、棕色、深棕色；阳性细胞所占的比例以0分（＜5%）、1分（5%～25%）、2分（25%～50%）、3分（50%～75%）、4分（＞75%）进行评价。染色评分以阳性细胞染色强度与阳性细胞所占的比例相加之和表示，范围为0～7分。NFAT2在早期NSCLC中的表达根据染色评分结果分为低表达（0～5分），高表达（6～7分）两组。

1.4统计学分析采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。其中NFAT2蛋白在组织中的表达采用Wilcoxon配对符号秩和检验；NFAT2表达与临床信息相关性采用χ2检验；生存分析采用Log-rank检验、Kaplan-Meier生存曲线及Cox回归分析。P≤0.05视为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 NFAT2蛋白在NSCLC中的表达免疫组化研究显示NFAT2主要在细胞核中表达。图1显示的是NFAT2在NSCLC肿瘤组织及其相应的癌旁正常组织中的表达情况。0～5分为低表达组，6～7分为高表达组，发现肿瘤组织中NFAT2高表达率为24.4%，而癌旁组织中则全部为低表达，差异有统计学意义（P＜0.001）（表1）。经Wilcoxon配对符号秩和检验发现，肿瘤组织中NFAT2染色评分中位数为5分，而癌旁组织中位数则为0分，差异具有统计学意义（P＜0.001），说明NFAT2蛋白在NSCLC肿瘤组织中的表达显著高于在癌旁组织中的表达（表2）。

表1　NSCLC及配对组织中NFAT2蛋白表达情况Tab 1 Theexpression ofNFAT2 protein in NSCLCand normaltissue

表2　NFAT2在NSCLC及配对组织中染色评分结果比较Tab 2 NFAT2 protein score in NSCLC and norm al tissue

图1　NFAT2在NSCLC组织芯片中的表达情况Fig 1 The exp ression of NFAT2 in TMA in NSCLC

2.2 NSCLC中NFAT2蛋白表达与临床病理资料的关联本研究分析了315例NSCLC癌组织中NFAT2免疫组织化学染色结果与临床病理资料的关联性。结果显示NSCLC中NFAT2蛋白表达与确诊年龄、性别、BMI分类、肺部疾病史、肿瘤家族史、吸烟史、组织学类型、肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤大小均无关联性（P＞0.05）（表3）。

2.3 NFAT2在NSCLC中的表达与预后的关系315例NSCLC从诊断之日起随访至2013年8月。Log-rank检验发现，在NFAT2低表达的NSCLC患者中，中位生存期为57.87月，NFAT2高表达的NSCLC患者中，中位生存期仅为38.40月，但差异不具有统计学意义。这与多因素调整的Cox回归分析显示的结果一致（P=0.842）。同时我们按照TNM临床分期将NSCLC分为早期（Ⅰ～Ⅱ期）和晚期（Ⅲ～Ⅳ期）两个亚组进行NFAT2表达与预后关联分析，仅发现预后趋势，但差异无统计学意义（早期：P=0.166，晚期：P=0.250）（表4）。

表3　NFAT2蛋白在肺组织芯片中与临床病理资料的关联Tab 3 Relationship between NFAT2 expression and clinicopatholo gical characteristics of NSCLC patients

表4　NFAT2在NSCLC中的表达与预后分析Tab 4 Association of NFAT2 expression w ith NSCLC survival

2.4 NSCLC中NFAT2表达与预后的分层分析NFAT2蛋白表达与NSCLC生存分析未见统计学意义。按照确诊年龄、性别、BMI分类、肺部疾病史、肿瘤家族史、吸烟史、组织学类型、肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤大小等变量进行分层分析，Log-rank检验发现，只有在早期女性及非吸烟NSCLC患者中，NFAT2高表达组总体生存率低于NFAT2低表达组，差异具有统计学意义（女性：P=0.003；非吸烟患者：P=0.001）（图2），表明NFAT2蛋白的高表达与早期女性及非吸烟NSCLC患者生存期缩短相关。而在315例NSCLC患者和112例晚期NSCLC患者中，分层分析未见统计学意义（P＞0.05）。

图2　女性及非吸烟患者中NFAT2表达与早期NSCLC生存关系的分层分析Fig 2 Subgroup analysis of early-stage NSCLC survival and NFAT2 expression in female and non-smokers

3　讨论

NFAT家族是最早发现存在于T淋巴细胞中的核转录因子，在免疫系统和免疫应答过程中发挥重要作用［5］。NFAT2位于18号染色体上（18q23），是NFAT家族中的重要亚型，在人类的淋巴组织中高度表达［6］。近年来多项研究表明NFAT家族在非免疫系统中存在广泛表达［7-8］，尤其是在肿瘤组织中［9-10］。研究发现NFAT1和NFAT2能够在肠癌细胞系中表达，活化后进入细胞核，调节下游基因COX2的转录，促进细胞侵袭［11］。NFAT1在成纤维细胞中可诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，而NFAT2则能够促进细胞增殖，诱导细胞转化。这说明NFAT2与NFAT1在肿瘤发展中可能发挥着不同的作用［12］，影响肿瘤的发生。现有研究证实NFAT2在乳腺癌、肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达，作为促癌基因影响肿瘤的进展及预后。NFAT2在将近70%的胰腺癌组织中高表达，阻断NFAT2活性可显著抑制胰腺癌细胞的生长［13］。在前列腺癌中，NFAT2在肿瘤组织中表达上调，Kaplan-Meier分析显示NFAT2的高表达能够引起前列腺癌切除治疗后的肿瘤复发，缩短无复发生存期（P=0.034）［14］。卵巢癌中NFAT2的高表达与肿瘤转移及不良预后有关（P=0.019）［15］。目前NFAT2在肺癌中的研究还很有限，赵立臣等［4］研究了NFAT家族在NSCLC中的作用，发现NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4在NSCLC中的高表达率分别为52.8%、11.3%、28.3%、47.2%，在肿瘤组织中的表达显著高于在其配对正常组织中的表达（P＜0.001），但NFAT2表达与NSCLC临床资料及生存预后之间的关系尚不清楚［4］。

本课题组通过研究NFAT2对NSCLC发生发展及生存预后的影响，一定程度上弥补了NFAT2在肺癌临床研究上的不足。笔者采用免疫组织化学技术对315例肺癌组织及164例配对的癌旁正常组织中NFAT2表达进行染色判定，发现NFAT2在NSCLC癌组织中表达上调，而对照组全部为低表达。赵立臣等［4］认为NFAT2在NSCLC高表达［4］，这与本研究结果一致。因此，笔者认为NFAT2在NSCLC中发挥促癌基因的作用。进一步分析并未发现NFAT2的表达同临床病理特征有关联。亚组生存分析显示，在早期NSCLC中，NFAT2表达上调预后较差；而在晚期NSCLC中，趋势相反，但两者均未见统计学差异。在女性及非吸烟早期NSCLC患者中，发现NFAT2高表达的患者预后较差。这说明NFAT2对NSCLC预后影响与TNM分期有关。

本研究发现NFAT2能够促进NSCLC的发生发展，但未进行相关作用机制的探索。现多数研究认为NFAT2对肿瘤的作用与其能够调节细胞功能有关。NFAT2能够下调E-Cadherin的表达，促进细胞侵袭［16］；在大B细胞淋巴瘤中，NFAT2能够调控cmyc、CD40L、BlyS等与细胞生长、肿瘤生存有关的因子［17］；而在卵巢癌中，NFAT2通过激活ERK1/2/ p38/MAPK信号通路上调c-myc表达，促进卵巢癌细胞增殖［15］。另有研究发现，NFAT2调控靶基因Tks5并介导肿瘤细胞与正常细胞的融合，影响细胞的转移能力［18］。作为一种转录因子，NFAT2可调控靶基因在肿瘤中的表达发挥促癌作用。在NSCLC中，研究者发现NFAT2与DNA损伤诱导凋亡抑制基因（DDIAS）启动子区域靶向结合，在A549细胞系中敲除NFAT2可导致DDIAS表达缺失，抑制细胞增殖［19］。本结果显示，NFAT2在NSCLC中高表达，与早期女性及非吸烟NSCLC患者不良预后有关。因此我们推测其可能通过促进肿瘤细胞的细胞增殖能力，增强其转移及侵袭能力来影响预后。

根据研究结果推测，作为促癌基因的NFAT2在NSCLC中表达上调预示着不良的预后结局，尤其是在早期NSCLC中，这可能与肿瘤的特征有关联。NFAT2可作为NSCLC早期诊断及治疗的标志物，笔者仍需扩大样本对NFAT2在NSCLC中的表达进行验证，对功能机制予以探索。

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（2016-03-10收稿）

Relationship between expression of NFAT2 and survival prognosis in non-small cell lung cancer

LI Jing-xin1，XU Fang-xiu1，2，WANG Yu1，GUO Yan1，3，QIAN Bi-yun1，4
（1.Department of Cancer Epidemiology and Biostatistics，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center of Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2.Department of Pharmacy，No. 401 Hospital of Chinese People's Liberation Army，Qingdao 266071，China；3.Department of Pathology，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China；4.School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200025，China）

O bjective：To study the relationship between the NFAT2 expression and the survival prognosis in non-small cell lung cancer（NSCLC）.M ethods：NFAT2 expression were detected by applying immunohistochemistry in 315 NSCLC cancer tissues and 164 adjacent normal tissues.Then，the relationship between NFAT2 expression and survival prognosis was studied in NSCLC.Results：NFAT2 increased in NSCLC tumor tissues（P＜0.001）.The subgroup analysis showed that in the early NSCLC women and non-smokers，NFAT2 expression was significantly correlated with shortened survival（P=0.003，P=0.001）.Conclusion：NFAT2 is a risk factor for NSCLC.NFAT2 high expression may indicate poor prognosis.

NFAT2；non-small cell lung cancer；immunohistochemistry

论著

R730.2

A

1006-8147（2016）05-0417-04

国家自然科学基金资助项目（81573231）；天津市自然科学基金资助项目（13JCYBJC23100）

李晶鑫（1988-），女，硕士在读，研究方向：肺癌病因学及分子流行病学；通信作者：钱碧云，E-mail：qianbiyun@126.com。