周闻，杨臻，刘民，汤华

（1.天津医科大学基础医学院病原生物学系生命科学中心实验室，天津300070；2.天津市天津医院检验科，天津300211）

抑癌基因ST7L对卵巢癌细胞增殖、细胞周期和裸鼠移植瘤的影响

周闻1，2，杨臻1，刘民1，汤华1

（1.天津医科大学基础医学院病原生物学系生命科学中心实验室，天津300070；2.天津市天津医院检验科，天津300211）

目的：研究ST7L基因对人类卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3细胞增殖、细胞周期和体内裸鼠成瘤模型的影响。方法：PCR扩增ST7L过表达质粒（pcDNA3/ST7L），生物合成ST7L的敲降质粒（pSilencer/ST7L）；利用脂质体转染技术在卵巢癌细胞中过表达或者敲降ST7L基因，用荧光定量PCR、Western blot验证质粒的有效性；MTT、克隆形成实验、流式细胞术检测ST7L对OVCAR3和SKOV3细胞增殖能力、周期的影响；并通过裸鼠移植瘤实验研究ST7L在体内成瘤能力。结果：过表达和敲降ST7L质粒是有效的；过表达ST7L后抑制了卵巢癌细胞生长，抑制了细胞G1/S期的转化；过表达ST7L在体内能够有效抑制裸鼠的成瘤能力。结论：ST7L抑制OVCAR3和SKOV3细胞的增殖能力，抑制细胞周期进程，抑制体内裸鼠成瘤能力。

抑癌基因ST7L；卵巢癌；移植瘤；细胞增殖；细胞周期；裸鼠

卵巢癌在女性肿瘤中是第二大常见肿瘤，但致死率却是最高的；上皮细胞性卵巢癌约占卵巢癌的90%，因此，研究上皮细胞性卵巢癌对于了解卵巢癌的发生发展和治疗具有重大意义［1-2］。据文献报道，上皮细胞性卵巢癌的发生发展主要是由癌基因或者抑癌基因的异常表达所引起，抑癌基因的失活会导致肿瘤的形成和恶性转化［3］。ST7L作为抑癌基因ST7的同源物被发现［4］，但是其在卵巢癌中的功能及其分子机制目前还不清楚。本研究主要是在卵巢癌细胞系中通过MTT实验、克隆形成实验、细胞周期实验对ST7L的功能进行探究并在裸鼠移植瘤中分析成瘤能力，确定ST7L在卵巢癌中的抑癌作用，为进一步研究其具体的分子机制奠定理论基础。

1　材料和方法

1.1细胞系人卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3为本实验室保存，其培养条件为含有10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培养液，细胞置于37℃含5%CO2的细胞孵箱中培养，每隔48～72 h用0.1%胰蛋白酶消化液消化细胞，进行传代培养。

1.2质粒构建

1.2.1过表达ST7L的质粒构建（1）PCR制备插入的外源片段：循环温度为：94℃5 min（预变性），94℃30 s（变性）、56℃30 s（退火）、72℃120 s（延伸）、33个循环，72℃10 min（延伸），产物大小约为1 700 bp的片段，酶切位点为Kpn I和Eco RI。

上游引物ST7L-S序列为5′CAGGGGTACCGCC ACCATGGCGGACCGTGGCGGCGTG3′；下游引物ST7L-AS序列为5′CCGGAATTCGCCAGAACTCAAA CCTAGGTCTTC3′。（2）将回收PCR产物连接至已切好的pcDNA3载体上。

1.2.2生物合成ST7L的敲降质粒上游引物为shR-ST7L-Top 5′GATCCAGTCCTCAGCATGAAGC TCAACTCGAGTTGAGCTTCATGCTGAGGACTTTTTT GA3′；下游引物为shR-ST7L-Bot 5′AGCTTCAAAA AAGTCCTCAGCATGAAGCTAACTCGAGTTGAGCTT CATGCTGAGGACTG3′。

1.3荧光定量PCR按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。然后使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，使用CWBIO公司的SYBR Green MasterMix进行荧光定量PCR。PCR进行40个循环，循环参数为（94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s）。引物如下：ST7L上游引物序列，5′CGCGGATCCCCTCTG TGTGTGTGTGTGTAAC3′，下游引物序列，5′CCGGA ATTCGCATTCCTGGGCAGGTCGGT3′；β-actin上游引物序列，5′CGTGACATTAAGGAGAAGCTG3′，下游引物序列，5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC3′。ST7L基因转录水平按照2-ΔΔCt法通过管家基因βactin进行校正。

1.4 Western blot用细胞裂解液RIPA从各组细胞中提取细胞全蛋白。蛋白样品用10%SDS-PAGE跑胶后用湿法转膜至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，4℃孵育ST7L（1∶2 000稀释）和GAPDH（1∶5 000稀释）一抗过夜。兔抗人多克隆抗ST7L抗体购自天津赛尔生物技术有限公司。充分洗膜后室温孵育二抗1 h。羊抗兔二抗购自天津赛尔生物技术有限公司。再次洗膜后于暗室中显影、定影，得到最终结果。

1.5 MTT 96孔板中分别转染4组细胞，分别在转染后48 h、72 h加入10 μL/孔5 mg/mL的MTT溶液；继续37℃温箱培养4～6 h，小心吸尽培养液，每孔加入100μL DMSO；避光振荡溶解结晶后用酶标仪于570 nm处检测吸光度OD值。每组实验重复3次。

1.6细胞周期流式细胞术收集转染后48 h的4组细胞，计数细胞，每管取6×105个细胞，然后严格按照周期检测试剂盒说明书进行操作，后经流式细胞仪检测。该试剂盒购自凯基生物有限公司。

1.7裸鼠移植瘤模型由中国科学院动物中心购买6周大的BALB/c免疫缺陷的裸鼠，转染过表达pcDNA3/ST7L质粒和pcDNA3对照质粒至OVCAR3细胞48 h后，计数1×106个细胞注射入裸鼠腋窝皮下。每组含5只裸鼠。剥离肿瘤观察其大小。

2　结果

2.1过表达质粒pcDNA3/ST7L和敲降质粒pSilencer/ST7L有效我们扩增了ST7L的过表达片段并连接至pcDNA3载体，命名为pcDNA3/ST7L；生物合成的敲降质粒命名为pSilencer/ST7L。图1示，过表达ST7L后能够明显升高ST7L的mRNA和蛋白水平；敲降ST7L后能够显著降低ST7L的mRNA和蛋白水平。该结果表明所构建的质粒是有效的。

2.2 ST7L抑制OVCAR3和SKOV3细胞的细胞活性图2示，过表达ST7L后，48 h、72 h后的细胞活性明显受到抑制；敲降ST7L后明显促进几个时间点的细胞活性。

图1　荧光定量PCR实验和western b lot实验验证质粒是有效的Fig 1 The plasm idsproved to be effective by RT-qPCR and western blot assay

图2　MTT实验分析过表达ST7L抑制OVCAR3和SKOV3的细胞活性Fig 2 Overexpression of ST7L supressed cell viability of OVCAR3 and SKOV3 by MTT assay

2.3ST7L抑制OVCAR3和SKOV3细胞的集落形成能力集落形成实验表明，在卵巢癌细胞中过表达ST7L后集落形成率较对照组明显受到抑制，抑制率大约为30%；敲降后的集落形成能力明显增强，增强了约1.4倍（图3）。

2.4 ST7L抑制OVCAR3细胞G1/S期转化流式细胞术检测分析结果发现，过表达ST7L能够明显抑制OVCAR3细胞G1/S的转化，敲降ST7L后能够有效地促进OVCAR3细胞G1/S期的转化（图4）。

2.5 ST7L抑制裸鼠成瘤的能力裸鼠移植成瘤模型实验结果表明，过表达ST7L的裸鼠组裸鼠的成瘤能力明显低于对照组，而且这种差异是有意义的（图5）。

3　讨论

2015年约有21 980例新增卵巢癌患者，14 270例患者死于该癌症［5］。目前的治疗手段主要为扩大性的手术治疗以及铂依赖的化疗［6-7］，70%～80%的癌症病人可以获得缓解性的手术治疗，但是绝大部分患者是难以治愈的［8］。卵巢癌高致死率的原因部分是因为早期难以诊断，75%的患者诊断出来已经到三期或是四期［9］。这些不断增加的病例很难治疗，导致5年的生存率低于30%［10］，因此研究卵巢癌的分子机制、提高早期诊断率对于治疗卵巢癌是有意义的。

ST7作为抑癌基因与wnt2基因成簇定位于7号染色体。Katoh等［4，11］通过生物信息学预测和cDNA-PCR确定了ST7的一个相关基因，并命名为ST7L，其包括有575个氨基酸。在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞性肺癌、脑膜瘤、黑色素瘤、急性淋巴癌等一系列癌症中，由于等位基因的缺失或者人类染色体区域的重组，ST7L可能作为新的抑癌基因发挥作用。Chen等［12］报道，在神经胶质瘤细胞中，ST7L抑制细胞的增殖能力和侵袭能力，并且可以诱导细胞凋亡。我们查阅大量文献［13-15］发现，ST7L在卵巢癌中作用及其分子机制到目前为止鲜有报道。我们构建了ST7L的过表达和敲降质粒，通过脂质体转染法转染质粒进入卵巢癌的OVCAR3和SKOV3两种细胞系，并且验证了质粒有效性。MTT和克隆形成实验表明，ST7L能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力；流式细胞术检测细胞周期发现，ST7L能够阻滞细胞由G1期向S的转化；裸鼠的移植瘤模型发现，ST7L能够抑制移植瘤的生长。

综上所述，本研究可以确定ST7L在卵巢癌中作为抑癌基因影响着细胞的生长增殖能力以及细胞的周期转化。这为进一步研究ST7L在卵巢癌中具体分子机制及其相关通路奠定了工作基础，也为早期诊断卵巢癌找寻新的靶标分子提供了一定的参考价值。

图3　克隆形成实验检测ST7L对克隆形成能力的影响Fig 3 The effects of ST7L on colony formation rate by colony form ation assay

图4　过表达ST7L阻滞OVCAR3细胞由G1期向S期转化Fig 4 ST7L overexpressed inhibited G1/S progess of OVCAR3

图5　裸鼠移植瘤模型分析ST7L对体内成瘤能力的影响Fig 5 The effects of ST7L on grow th ability by tum or xenograft model in vivo

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（2016-03-11收稿）

Effects of ST7L on cell proliferation，cell cycle in ovarian cancer and tumour xenografts in nude m ice

ZHOU Wen1，2，YANG Zhen1，LIU Min1，TANG Hua1
（1.Life Science Research Center，Department of Pathogen Biology，Basic Medical School，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Department of Clinical Laboratory，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China）

Objective：To investigate the effects of ST7L on the proliferation，cell cycle in ovarian cancer and tumor xenograft in nude mice.M ethods：Ectopic expression plasmid of ST7L by PCR and compounded the knockdown plasmid were established.ST7L was overexpressed and knocked down in OVCAR3 and SKOV3 cells via lipidosome 2000 transfection.Fluorescence based quantitative polymerase chain reaction and western blot assay were used to analyze the expression of ST7L.MTT，colony formation assay and flow cytometry were applied to detect the effects of ST7L on the proliferation and cell cycle of OVCAR3 and SKOV3 cells after transfection.Tumor xenograft studies were used to observe the tumor growth in vivo.Results：The used plasmids were effective；the ectopic expression of ST7L suppressed the proliferation and cell cycle of OVCAR3 and SKOV3 cells，and the tumor growth was inhibited by over-expression of ST7L in vivo. Conclusion：ST7L could inhibit the proliferation and cell cycle of ovarian cells and tumor growth in nude mice.

ST7L；ovarian cancer；tumor xenograft；cell proliferation；cell cycle；nude mice

国家自然科学基金资助项目（91029714； 31270818；81572790）；天津市自然科学基金资助项目（12JCZDJC25100）

周闻（1982-），女，硕士在读，研究方向：病原生物学；通信作者：汤华，E-mail：htang2002@yahoo.com。

R737.31

A

1006-8147（2016）05-0373-04