马存强，周斌星，杨超，王洪振，徐正文

1.昆明大朴茶业有限公司，云南 昆明 650224；2.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；

3.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；4.贵州仙源红古树茶业有限公司，贵州 贵阳550002

HPLC指纹图谱技术在景迈茶区晒青毛茶鉴别中的应用研究

马存强1，2，周斌星2，3*，杨超2，王洪振2，徐正文4

1.昆明大朴茶业有限公司，云南 昆明 650224；2.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；

3.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；4.贵州仙源红古树茶业有限公司，贵州 贵阳550002

以80个不同年份的景迈、芒景春季晒青毛茶为材料，通过HPLC指纹图谱技术分别构建了景迈与芒景春季晒青毛茶的标准色谱图。在景迈春茶标准色谱图中有 22个特征峰，芒景春茶标准色谱图中有 24个特征峰，有 18个共有峰，其中景迈春茶与芒景春茶仅在表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量上存在一定差异。在景迈春茶、芒景春茶的聚类分析中，由于普洱茶陈化的不确定性和两地晒青毛茶的相似性，在不同年份晒青毛茶聚类分析中存在一定误差，在 20个茶样中有 1个茶样未被成功聚类。在景迈茶区与其他茶区晒青毛茶聚类分析中，能将景迈茶区春茶（包括景迈春茶与芒景春茶）成功聚类，并与其他茶区区别开来。通过相似度分析，景迈、芒景茶样与标准色谱相似度较高，分别为98.9%和99.2%，其他茶区春季晒青毛茶与标准色谱相似度较差，在 95%以下。由此可知，HPLC指纹图谱技术可用于景迈茶区相同年份相同季节晒青毛茶的鉴别，为普洱茶不同茶区晒青毛茶的鉴别提供了较为科学的方法。

指纹图谱；景迈；晒青毛茶；聚类分析

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种［Camellia sinensis var.assamica（Mast.）Kitamura］晒青毛茶为原料，利用一定工艺制成的具有独特品质特征的茶叶［1］。作为原料，晒青毛茶的质量直接关系到普洱茶成品的品质。云南丰富的茶树种质资源、独特的地理位置、得天独厚的气候条件蕴育出不同类型的普洱茶。其中，“山头茶”由于高品质、稀缺性得到社会的认可与追捧。然而，“山头茶”等名贵茶叶主要依据感官品质特征进行评定，结果存在一定误差且需要经验的积累。因此迫切需要将不同产区的晒青毛茶量化，并建立客观公正的鉴别方法。

HPLC指纹图谱技术通过标准色谱图的建立，结合聚类分析法（Cluster Analysis，CA），主成分分析法（Principal Analysis，PCA）和相似度分析法（Similarity Analysis，SA）等分析方法已在中草药鉴别［2-3］、茶叶分类［4-8］中已有了深入的研究。景迈茶区处于云南省普洱市澜沧县景迈山，涉及区域范围内共包括景迈和芒景两个行政村。其中景迈村有芒埂、勐本、景迈、糯岗4个村寨；芒景村有翁基、芒景上寨、芒景下寨、芒洪4个村寨。本研究以2011～2014年地理位置相邻近的景迈、芒景春季晒青毛茶为材料，分别建立景迈、芒景春季晒青毛茶的标准色谱图，并结合聚类分析法、主成分分析法和相似度分析法尝试鉴别不同茶区、不同年份晒青毛茶。

1　材料与方法

1.1材料

本实验所用茶样均由实验者于当地采集。茶样（n=80）茶叶品种为澜沧拉祜族自治县惠民乡景迈芒景茶区 2011～2014年不同样品点采集的春茶茶样（鲜叶要求为一芽二三叶）。其中 2011年景迈春茶 10个茶样，编号为J1～J10；2012年景迈春茶10个茶样，编号为J11～J20；2013年景迈春茶10个茶样，编号为J21～J30；2014年景迈春茶10个茶样，编号为J31～J40；2011年芒景春茶10个茶样，编号为M1～M10；2012年芒景春茶10个茶样，编号为M11～M20；2013年芒景春茶10个茶样，编号为M21～M30；2014年芒景春茶10个茶样，编号为M31～M40。所有样品均由当地制茶师按照当地晒青毛茶制作工艺制作完成。晒青毛茶制作完成后均放置于铝箔袋中常温储存。

另有他人提供的景迈山春季晒青毛茶茶样若干，用于不同年份景迈茶区春季晒青毛茶的聚类分析。在茶叶市场购买和在云南其他茶区收集的晒青毛茶或者普洱茶（生茶）共 10个茶样，分别为冰岛、双江、勐库、班章、勐宋、攸乐、老尖山的晒青毛茶和大益、下关的普洱茶（生茶），用于不同茶区茶叶的聚类分析。滇红、福鼎白茶和普洱茶（熟茶）等 12个不同类型茶样用于相似度分析。

1.2试验方法

1.2.1HPLC色谱图

上样液制备：称取3 g磨碎试样于500 mL锥形瓶中，加沸蒸馏水450 mL，立即移入沸水浴，浸提45 min（每隔l0 min摇动1次）。浸提完毕后立即趁热减压过滤并定容至500 mL。茶汤经0.45 µm水系膜过滤后进样，进样量为10 µL。

色谱条件［9］为：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%乙酸水溶液，色谱柱：安捷伦反相Cl8色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为 280 nm；柱温为 30℃。流速为 1 mL·min-1，梯度洗脱：0～50 min时，A相由8%升至31%，50 min后，A相保持31%，再运行10 min。在此洗脱梯度下，出峰时间均分布，且集中在0～35 min。

经考察，保留时间RSD＜3%，峰面积RSD ＜3%；经过自动匹配，各指纹图谱相似度在97%以上。该色谱方法有较好的精密性、稳定性和重复性，可用于指纹图谱研究。

1.2.2感官审评

参照 GB/T 22111—2008《地理标志产品普洱茶》，GB/T 23776—2009，《茶叶感官审评方法》，GB/T 14487—2008《茶叶感官审评术语》结合晒青毛茶审评方法对景迈、芒景春季晒青毛茶的色泽、香气、滋味、叶底进行审评，并记录两地晒青毛茶的共同点和差异。

1.2.3主要生化成分检测

水浸出物含量测定，参照 GB/T 8305—2013 茶 水浸出物测定；茶多酚含量测定，参照 GB/T 8313—2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法；游离氨基酸总量测定采取茚三酮显色法。

1.3数据分析

指纹图谱数据在分析前做了适当的预处理，包括背景扣除，谱峰校准等，利用计算机辅助软件（中药色谱相似度评价系统）建立80个样品的高效液相色谱数据的共有模式，以此提取出其特征指纹图谱。

1.3.1聚类分析方法

聚类分析采用 SAS软件，以样品指纹图谱中色谱峰的峰面积为输入变量，采用聚类分析方法考察样本的分类情况，以观察其他色谱峰对分类结果的影响，最后绘制树状图，将样品分类。

1.3.2主成分分析方法

主成分分析法采用SPSS19.0软件，以样品中分析选定7个主成分，以其峰面积输入软件进行分析得到投影图，用来解释样品与样品，样品与变量以及变量与变量之间的关系。主成分分析结果予以佐证聚类分析法的结果。

1.3.3相似度分析法

采用SPSS 19.0软件，将样品图谱与标准色谱图中的共有峰峰面积进行相关性分析，得出样品与标准色谱图的相似度。

2　结果与分析

2.1感官审评结果分析

从审评结果（表1）可知，景迈茶与芒景茶均表现出优质普洱茶（生茶）的品质特征。景迈茶与芒景茶表现出共性，也存在差异性，且共性大于差异性。由于景迈与芒景同属于景迈山古茶园，地理位置相接近，制茶工艺不存在明显差异，因而两地晒青毛茶在外形、色泽等方面不存在差异，滋味的差异性仅表现在芒景晒青毛茶苦涩感明显，收敛性较景迈茶强的特点。因此，依照传统感官审评的方法很难鉴别区分景迈与芒景晒青毛茶的差异。

2.2景迈、芒景茶区春季晒青毛茶指纹图谱的绘制

通常建立同类中药及制剂指纹图谱主要采用一维指纹图谱，构建共有模式的方法主要是平均值法或中位数法。本研究采用平均值法绘制标准图谱。景迈、芒景春季晒青毛茶HPLC指纹图谱叠加图如图1、图2所示。采用平均数法构建的标准图谱见图3与图4。

由图1和图2可直观看到，各色谱峰的峰型良好，分离度较好，同时茶样相对保留时间比较稳定，各色谱图重叠性良好。采用线性和重复性进行数据筛选，在景迈茶区春季晒青毛茶指纹图谱中筛选出 22个可以用来定量的峰，在芒景茶区春季晒青毛茶指纹图谱中筛选出24个可以用来定量的峰，其他的峰则因为存在较大的误差而被舍弃。采用多点校正以及平均数法生成景迈与芒景茶区春季晒青毛茶的标准图谱分别为图3和图4。

比较相同茶区的40个样品的色谱图，可直观地看出同一产地的色谱图相似度较高。通过比较分析景迈、芒景两茶区的标准色谱图，可直观看出两地色谱图存在一定差异性。主要表现在定量波峰数量上的差异（景迈标准图谱中共22个定量峰，芒景标准图谱中共24个定量峰）和某些定量峰峰面积以及峰高上的差异。

表1　茶叶审评结果Table 1 The results of tea sensory evaluation

图1　40个景迈春茶茶样HPLC指纹图谱叠加图Fig.1 The superposition of HPLC fingerprint diagram for 40 Jingmai spring tea samples

图2　40个芒景春茶茶样HPLC指纹图谱叠加图Fig.2 The superposition of HPLC fingerprint diagram for 40 Mangjing spring tea samples

图3　景迈茶区春茶标准图谱（平均数法）Fig.3 Standard diagram for spring tea from Jingmai tea area（mean value analysis）

图4　芒景茶区春茶标准图谱（平均数法）Fig.4 Standard diagram for spring tea from Mangjing tea area（mean value analysis）

2.3指纹图谱分析与评价

根据80个供试样品溶液HPLC指纹图谱给出的参数，比较供试品图谱，其中18个峰是80个供试样品所共有，因此，确定18个峰为80个供试样品的共有峰，并指认了其中10个共有峰（图 5）。分别为 GA（4号峰），GC（5号峰），可可碱（6号峰），茶叶碱（7号峰），EGC（8号峰），儿茶素（13号峰），咖啡碱（14号峰），EGCG（16号峰），GCG（17号峰），ECG（18号峰）。通过两茶区标准色谱图比对可知，在景迈春茶色谱中16号峰（EGCG）低于 18号峰（ECG）；在芒景春茶色谱中16号峰（EGCG）高于18号峰（ECG）。两产区春季晒青毛茶对比可知，两地春季晒青毛茶仅在EGCG和ECG含量上存在一定差异。EGCG与ECG在苦涩味与收敛性上存在差异。研究认为 EGCG苦涩度与收敛性略强于ECG［10-12］。EGCG与ECG含量的差异可能是芒景茶在滋味上较景迈茶苦涩明显，收敛性强的物质基础。景迈春季晒青毛茶与芒景春季晒青毛茶存在差异的原因来自于两茶区不同的海拔高度和茶林的生态环境。

图5　景迈春茶（A）和芒景春茶（B）80个供测样品HPLC指纹图谱共有峰Fig.5 Common peaks of HPLC finger-print from 80 test samples of Jingmai spring tea（A）and Mangjing spring tea（B）

2.4聚类分析结果

基于10个共有峰的峰面积数据对80个供试茶样采用类平均法进行聚类分析。结果如图6所示。景迈，芒景春茶虽然属于同一地区、茶树品种相同、加工工艺类似，但由于两茶区海拔高度存在明显差异，通过聚类分析，依旧可以分为景迈春茶和芒景春茶两类。

2.5主成分分析验证结果

通常，检验一种化学计量学方法的正确性是采用另一种化学计量学方法对同样的数据进行验证，在这种情况下，最好是采用一种算法完全不同的方法来进行验证［12］。笔者对共有模式的色谱数据进行主成分分析，取得累积贡献率大于80%的7个主成分。根据7个主成分的峰面积大小进行主成分分析，得到主成分投影图（图7）。从图7上可以看出80个样品明显分为两类。从另一方面验证了HPLC指纹图谱可用于不同茶区晒青毛茶的鉴定。

2.6HPLC指纹图谱技术的应用

随机选取 10份景迈春茶和芒景春茶茶样，其中包含他人提供的确定来自景迈山茶区的春季晒青毛茶茶样。结果（图 8）显示，9个不同年份的景迈春茶茶样很好地聚在芒景春茶一类里，10个不同年份的芒景春茶很好地聚在芒景春茶一类里，另1个景迈茶样被单独聚类。猜测原因主要来自于晒青毛茶陈化的不确定性和景迈春茶与芒景春茶较高的相似度。因此，基于指纹图谱在不同年份和相邻茶区的晒青毛茶中的聚类分析存在一定误差。

从40个景迈春茶晒青毛茶和40个芒景春季晒青毛茶中随机分别抽取10个景迈茶样与10个芒景茶样，并选取10个其他产区的春季晒青毛茶或普洱茶（生茶）进行聚类分析。聚类分析结果（图9）显示，景迈春茶与芒景春茶能够被成功聚类，与所选取其他10个不同产地的春季晒青茶样区分开来。因此基于HPLC指纹图谱的共有峰聚类分析法可用于景迈茶区同一季节的晒青毛茶鉴定。

图6　80个样品聚类图Fig.6 Dendrogram of 80 tea samples

将测试茶样图谱与景迈、芒景春季晒青毛茶标准色谱图进行相似度分析，结果如表2所示。不同茶样与景迈、芒景春季标准色谱图的相似度分别在80.3%～98.9%，80.3%～99.2%之间。其中景迈、芒景茶区与标准色谱图相似度较高，分别为98.9%与99.2%；滇红、福鼎白茶、普洱茶（熟茶）因加工工艺与晒青毛茶不同，与标准色谱图相似度最低，均在 85%以下；不同茶区的晒青毛茶以及成品普洱茶（生茶）与标准色谱图相似度在91.1%～94.5%之间。通过标准图谱结合相似度分析，可对景迈茶区春茶（包括景迈春茶和芒景春茶）和其他茶区晒青毛茶进行鉴别。

注：△代表景迈春茶，□代表芒景春茶。Note：△ is representative of Jingmai spring tea，□is representative of Mangjing spring tea.图7 主成分分析图Fig.7 The results of principal component analysis

3　讨论

本研究以不同年份的景迈春季晒青毛茶、芒景春季晒青毛茶为材料，通过HPLC指纹图谱技术分别建立了景迈与芒景春季晒青毛茶的标准指纹谱图。通过景迈与芒景标准指纹图谱对照可知，两地晒青毛茶相似度较高，仅在EGCG和ECG含量上存在一定差异。而这种差异主要由两地海拔不同和茶林生态环境的不同产生的。HPLC指纹图谱在不同产地晒青毛茶的鉴别中，可将景迈茶区晒青毛茶成功聚类，并与其他茶区的普洱茶区别开来。通过相似度分析可知，景迈、芒景茶样与标准色谱图相似度较高，分别为98.9%和99.2%，其他茶区春季晒青毛茶与标准色谱相似度相对偏低，在95%以下，由此可将景迈茶区晒青毛茶与其他茶区茶叶区别开来。因此可知，HPLC可用于景迈茶区春季晒青毛茶的鉴别。

在普洱茶陈化过程中，由于微生物的参与、陈化环境的差异，茶叶中的内含成分发生较大变化［13-16］，增加了普洱茶鉴定的难度。景迈与芒景均位于景迈山上，仅在海拔和茶林生态环境上存在差异，因而景迈与芒景春茶相似度较高。在不同年份的景迈、芒景春茶聚类分析中出现一定误差，在20个茶样中有1个茶样未被成功聚类。关于不同年份相邻产地普洱茶的鉴别有待进一步研究。

4　结论

通过HPLC指纹图谱技术结合聚类分析、主成分分析、相似度分析可用于鉴别相同年份、不同茶区的春季晒青毛茶，弥补了感官审评等鉴别方法的不足，为普洱茶不同茶区晒青毛茶的鉴别提供了较为科学的方法。

图8　不同年份的景迈、芒景春茶茶样聚类分析图Fig.8 Dendrogram of Jingmai，Mangjing tea samples of different years注：景迈1～景迈5和芒景1～芒景5分别为他人提供的景迈、芒景春季晒青毛茶茶样。Note：Jing-mai 1-Jing-mai 5 and Mang-jing 1-Mang-jing 5 tea samples were offered by others using Jing-mai and Mang-jing spring sun-dried tea.

表2　茶样与景迈、芒景春季晒青毛茶标准图谱的相似性比较Table 2 Similarity analysis of standard diagrams of Jingmai and Mangjing spring tea and tea samples

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Identification of Spring Sun-dried Tea from Jingmai Area by HPLC Fingerprint

MA Cunqiang1，2，ZHOU Binxing2，3*，YANG Chao2，WANG Hongzhen2，XU Zhengwen4

1.Kunming Dapu Tea Industry Co，Kunming 650224，China； 2.LongRun Pu-erh Tea College，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China； 3.College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；4.Guizhou Xianyuanhong Old Tree Tea Industry Co，Guiyang 550002，China

Using 80 spring sun-dried tea samples from Jingmai and Mangjing and different years as materials，standard chromatograms of Jingmai and Mangjing spring tea were constructed by HPLC fingerprint.There were 22 and 24 characteristic peaks in Jingmai and Mangjing standard chromatograms respectively，with 18 shared peaks.Jingmai and Mangjing spring sun-dried tea showed large differences in EGCG and ECG contents.Because of the uncertainty in pu-erh tea storage and the high similarity between Jingmai and Mangjing spring sun-dried tea，there might be some errors in cluster analysis of different years.For example，one of 20 tea samples can not be clustered successfully.Cluster analysis could successfully distinguish spring sun-dried teas from Jingmai area（including Jingmai spring tea and Mangjing spring tea）from other areas.Similarity analysis showed that the similarities between the standard chromatogram and tea samples from Jingmai and Mangjing were 98.9% and 99.2%，which werelower than 95% for tea samples from other areas.In conclusion，HPLC fingerprint was able to identify the sun-dried tea production areas in Jingmai of the same year，which provided a more scientific and complete method for the identification of sun-dried tea from different areas.

HPLC fingerprint，Jing-mai，sun-dried tea，cluster analysis

TS275.2

A

1000-369X（2016）04-379-10

2016-01-13

2016-04-08

紫鹃茶树调控花色苷生物合成的MBW转录因子复合体研究（C161104）、普洱市古茶园申报世界物质文化遗产（kx14040）。

马存强，男，硕士研究生，主要从事茶叶加工与综合利用方向的研究。*通讯作者：bxzhou01@126.com