李明华，孟秀梅，陆正清*，陈　军

（江苏食品药品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安223003）

酶法提取金针菇菇脚可溶性膳食纤维的工艺优化

李明华，孟秀梅，陆正清*，陈军

（江苏食品药品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安223003）

以金针菇菇脚为原料，对纤维素酶法提取可溶性膳食纤维的工艺条件进行了优化。在单因素试验的基础上，考察了液料比、加酶量和酶解时间对可溶性膳食纤维提取率的影响，通过响应面法确定最佳提取工艺。结果表明，在物料粒度80目、液料比19∶1（m L∶g）、加酶量42 U/g、酶解时间2 h的条件下，金针菇菇脚可溶性膳食纤维的提取率最高，为14.45%。说明应用响应面法优化纤维素酶法提取可溶性膳食纤维的工艺是一种行之有效的方法。

金针菇菇脚；可溶性膳食纤维；纤维素酶；响应面法

金针菇，学名毛柄金钱菌（Flammulina velutipes），是我国最早进行人工栽培的食用菌之一，产量仅次于香菇、黑木耳和平菇，位居第四位。金针菇富含蛋白质、多糖、膳食纤维以及多种氨基酸、维生素和铁、锌、硒等微量元素，具有很高的药用食疗价值［1］。金针菇除了直接鲜食外，还以其为原料加工成金针菇面条、饮料、果冻、酸奶等食品［2-5］。

在金针菇生产及加工过程中，产生了大量的菇脚、菌柄等下脚料，这些下脚料含有丰富的蛋白质、膳食纤维和多糖等物质，但往往不经过处理即直接丢弃，既污染了环境又造成了极大的资源浪费。因此，充分利用金针菇加工副产物势在必行。近年来，已有少量从金针菇下脚料提取生物活性物质的报道，如应用微波或超声辅助法浸提多糖［6-8］、应用碱提工艺提取蛋白质［9-10］等。此外，黄家莉等［11-12］应用碱提法提取了金针菇菇脚中不可溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）。膳食纤维具有优良的生理保健功能［13-15］，在维持膳食平衡方面发挥着重要作用，被称为人类“第七大营养素”。应用碱提法提取膳食纤维除了会产生大量的废水外，制备的产品颜色较深，不适合食品、药品工业的进一步加工［16］。因此，本研究以金针菇菇脚为原料，应用纤维素酶法提取SDF，并采用响应面法优化其提取工艺参数，以期为金针菇下脚料的充分利用提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金针菇菇脚：新鲜金针菇购于农贸市场，清杂后将菇脚与子实体切分后备用；复合蛋白酶（1.5 AU/g）：丹麦诺维信（中国）投资有限公司；纤维素酶（15 000 U/g）：上海沪试实验室器材股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

WR-1恒温水浴振荡器：上海思尔达科学仪器有限公司；DGG-9246A电热鼓风干燥箱：北京恒泰丰科试验设备有限公司；R-205旋转蒸发仪：上海申胜生物技术有限公司；北京中兴伟业仪器有限公司；AL104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDL-60B低速离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1SDF提取工艺流程

金针菇菇脚→清洗→干燥→粉碎→过筛→蛋白酶水解→灭酶→纤维素酶水解→抽滤取上清液→减压浓缩→醇沉过夜→离心分离→醇洗→真空干燥→SDF成品

1.3.2操作要点

取新鲜的金针菇菇脚，清除杂质，用自来水冲洗干净，沥干后置于鼓风干燥箱80℃烘干，然后将其粉碎，过分样筛。取5 g菇脚粉加入20倍质量的纯净水，调pH至6.0后加0.1%复合蛋白酶，在恒温振荡器中40℃酶解，通过双缩脲试剂检测直至无紫红色产生为止，以除去蛋白质。除蛋白后，将悬浊液pH调至4.6，加热至60℃保持20 min灭酶，冷却。在冷却至50℃的混合液中加入适量的纤维素酶，然后在50℃恒温水浴振荡器中酶解一定时间后抽滤，滤液减压浓缩，再按1∶4（V/V）的比例加入无水乙醇，静置过夜后，5 000 r/m in离心10 min，最后经过5倍体积无水乙醇洗涤后，真空干燥即得SDF成品。

1.3.3SDF提取率计算方法

将制备的SDF充分干燥后，准确称其质量，SDF提取率计算公式如下：

1.3.4SDF提取的单因素试验

按照商品纤维素酶的使用说明，在最适反应温度和pH条件下，分别考察物料粒度（50目、60目、70目、80目、90目、100目）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（m L∶g））、加酶量（25 U/g、30 U/g、35 U/g、40 U/g、45 U/g、50 U/g）和酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）对SDF提取率的影响。

1.3.5SDF提取的响应面工艺优化

在单因素试验的基础上，以液料比、加酶量和酶解时间为变量，以SDF提取率（Y）为响应值，应用Design Expert 8.0软件设计3因素3水平响应面分析试验，然后按照试验方案进行试验，优化提取工艺，确定最佳工艺参数。

1.3.6SDF持水力测定

准确称取0.5 g粉碎至60目的SDF粉末于50 m L离心管中，加入25m L纯净水，室温下均匀搅拌60 min后，4 000 r/min离心10 min，除去上清液，称量样品湿质量，计算SDF的持水力，持水力计算公式如下：

1.3.7SDF膨胀力测定

准确称取0.5 g粉碎至60目的SDF于15 m L刻度试管中，记录干样体积，加入10 m L纯净水，振荡均匀后，室温静置24 h，记录膨胀后的体积，计算SDF的膨胀力，膨胀力计算公式如下：

2　结果与分析

2.1单因素对SDF提取率的影响

2.1.1物料粒度对SDF提取率的影响

物料粒度对SDF提取率的影响如图1所示。由图1可知，随着物料粒度的减小，SDF提取率逐渐提高，在物料粒度为80目时，提取率基本达到最大。这是因为物料颗粒越小，其表面积就越大，与酶的接触越充分，被降解的纤维素越多，相应可溶性SDF含量越高。但进一步减小物料的粒度，SDF的提取率并没有明显的提高。考虑到物料颗粒越细，对原料粉碎及酶解后抽滤难度越大，因此在后续研究中，均以过80目筛的物料为研究对象。

图1　物料粒度对SDF提取率的影响Fig.1 Effect of the material size on the extraction rate of soluble dietary fiber

2.1.2液料比对SDF提取率的影响

图2　液料比对SDF提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of soluble dietary fiber

液料比对SDF提取率的影响如图2所示。由图2可知，液料比对SDF提取率的影响比较显著。液料比越高，反应体系黏度越低，越有利于底物的水解及SDF的扩散，反应越充分，在液料比为20∶1（m L∶g）时，SDF提取率最高，达13.18%。但在反应体系中，纤维素酶添加量一定，过高的液料比反而会降低酶的浓度，不利于底物与酶的接触，从而降低底物的水解率，使SDF提取率呈下降趋势。另外，液料比越大，后期的真空浓缩工作量越大，耗能越高，因此，为了保证试验效果、降低工作量和减少耗能，液料比选择20∶1（m L∶g）为宜。

2.1.3加酶量对SDF提取率的影响

加酶量对SDF提取率的影响如图3所示。由图3可知，SDF提取率随着纤维素酶添加量的增大逐渐提高，在加酶量为40 U/g时，SDF提取率达到最大13.23%；继续增加纤维素酶添加量，SDF提取率不再提高，反而有所下降。这是因为市售的纤维素酶多为复合酶，具有内切、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，既可以降解纤维素转变为SDF，也可将之进一步降解为不能被乙醇沉淀的纤维二塘和单糖［16］，同时该类小分子糖又会抑制纤维素酶内切酶活性。因此，加酶量过大，反而导致SDF提取率逐渐下降。因此选择加酶量40 U/g为宜。

图3　加酶量对SDF提取率的影响Fig.3 Effect of enzyme addition on the extraction rate of so luble dietary fiber

2.1.4酶解时间对SDF提取率的影响

图4　酶解时间对SDF提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of soluble dietary fiber

酶解时间对SDF提取率的影响如图4所示。由图4可知，酶解时间显著影响SDF提取率，随着酶解时间的延长，SDF提取率先升后降。在酶解前期，反应体系中底物浓度高而可溶性多糖含量低，有利于酶促反应的进行，且反应时间越长，酶解越充分，SDF的提取率就越高，且在酶解3 h时达到最高，为13.45%。继续延长反应时间，酶在高温下逐渐失活，且SDF更多的被酶解为小分子的糖，导致提取率逐渐降低。因此选择酶解时间3 h为宜。

2.2响应面优化试验结果与分析

2.2.1数学模型的建立与显著性分析

单因素试验结果表明，在纤维素酶的最适反应温度和pH条件下，液料比、加酶量和酶解时间均对SDF提取率影响显著，因此以以上3个因素作为变量，以SDF提取率（Y）为响应值，设计响应面优化试验，确定SDF提取的最佳反应条件。响应面试验因素与水平见表1，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1　响应面设计试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2　响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

将表2的试验结果采用Design Expert 8.0软件进行多元回归拟合，得到关于SDF提取率对液料比、加酶量和酶解时间的二次多元回归方程：

Y=14.45-0.094A-0.069B-0.1C+0.012AB-0.003AC-0.2BC-0.16A2-0.17B2-0.087C2

表3　回归模型方差分析Table 3 Va riance ana lysis of regression m odel

由SDF提取率的二次回归模型方差分析（表3）可知，模型P=0.000 3＜0.01，达到了极显著水平，模型P=0.000 3＜ 0.01，达到了极显著水平，且失拟项P=0.906 8＞0.05，不显著，说明模型预测值与实际值拟合较好，可用回归方程代替实验真实值对试验结果进行分析。另外，该模型的决定系数R2=0.964 6，调整决定系数R2Adj=0.919 1，变异系数为0.41，说明模型拟合度较好，试验误差小，可用该模型预测SDF在不同工艺条件下的提取率。由方差分析结果还可以看出，各因素对SDF提取率的影响大小依次为：酶解时间＞液料比＞加酶量；方程中一次项A、C，二次型A2、B2和交互项BC对SDF提取率影响极显著，B和C2影响显著，这表明除了一次项外，二次项和交互项对SDF提取率也有影响。

2.2.2响应面及等高线分析

响应面及等高线图能够直观地反映出各因素间交互作用对响应值的影响程度，曲面越陡，等高线越密集，影响越显著［17］。液料比、加酶量和酶解时间交互作用对SDF提取率影响的响应面和等高线见图5。由图5可知，加酶量和酶解时间的交互作用对SDF提取率的影响极显著，而料液比与加酶量、料液比与酶解时间的交互作用影响不显著，这与表3中的分析结果相一致。

图5　液料比、加酶量和酶解时间交互作用对SDF提取率影响的响应面及等高线Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on so luble dietary fiber extraction rate

2.3提取工艺验证试验

经过软件分析可知，当液料比为19.06∶1（m L∶g），加酶量为41.78 U/g，酶解时间为2.02 h时，应用纤维素酶提取金针菇菇脚SDF提取率最高，达到14.50%。为便于实际操作，分别选取液料比、加酶量和酶解时间为19∶1（m L∶g）、42 U/g和2 h，在此条件下进行提取试验，以验证模型预测的准确性。结果表明，3次平行试验中SDF提取率的平均值为14.45%，与理论预测值相差不大，且高于碱提法金针菇菇脚SDF的提取率［12］。由此可见，应用响应面法优化酶法提取金针菇菇脚SDF的工艺条件是准确和可行的。

2.4SDF性质测定

膳食纤维分子中含有大量的亲水基团，具有较高的持水力和膨胀力，该性能为衡量膳食纤维品质优劣的两个重要指标，持水力和膨胀力越大，其生理活性和加工特性越好［18］。经测定，本实验从金针菇菇脚制备的SDF持水力为3.52 g/g，膨胀力为5.64 m L/g，均高于胡春晓等［19］提取的香菇柄SDF的持水力和膨胀力，持水力高于但膨胀率低于吴素蕊等［12］提取的金针菇菇脚SDF。

3　结论

在纤维素酶法提取金针菇菇脚SDF的过程中，液料比、加酶量和酶解时间均对SDF提取率有显著影响。在物料粒度为80目时，通过响应面优化试验，得到了金针菇菇脚SDF最佳提取工艺参数，即液料比19∶1（m L∶g），加酶量42 U/g，酶解时间2 h，在此工艺条件下，金针菇菇脚SDF提取率为14.45%，与理论值基本相符。与碱提法相比，纤维素酶法条件温和、提取率高、产品品质好，为综合利用金针菇下脚料提供了理论依据。

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Optim ization of enzymatic extraction conditions for soluble dietary fiber from Flammulina velutipes feet

LI M inghua，MENG Xiumei，LU Zhengqing*，CHEN Jun
（School of Biological and Chem ical Engineering，Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai′an 223003，China）

Using the Flammulina velutipes feet as raw material，the cellulase extraction conditions of soluble dietary fiber were optim ized.On the basis of single factor experiments，the effects of liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on extraction rate of soluble dietary fiber were investigated.And the optimum extraction conditions were optim ized by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions were particle size 80 mesh，liquid-solid ratio 19∶1（m l∶g），enzyme 42 U/g and enzymolysis time 2 h.Under the conditions，the extraction rate of soluble dietary fiber in F.velutipes feet was up to 14.45%，which indicated that it was a very effective method to optim ize cellulase extraction conditions for soluble dietary fiber by response surface methodology.

Flammulina velutipes feet；soluble dietary fiber；cellulase；response surface methodology

TS201．1

0254-5071（2016）05-0119-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．025

2016-03-14

食用药用真菌产业科技公共服务平台（HAP201414）

李明华（1977-），男，讲师，博士，研究方向为天然产物活性成分。

陆正清（1967-），男，教授，硕士，研究方向为发酵食品。