杨会会，周志强，韩二芳，王　娟，刘　欣

（河南农业职业学院，河南郑州　451450）



原子吸收光谱法测定血清中不同化学形态的钴与镍

杨会会，周志强，韩二芳，王娟，刘欣

（河南农业职业学院，河南郑州451450）

采用乙醇低温（4℃）沉淀蛋白法，将血清中的钴、镍分为结合态和非结合态，利用石墨炉原子吸收光谱法灵敏度高、取样量少的优点，测定血清中的钴、镍2种元素的总量及非结合态含量，通过差减法求出血清中结合态元素含量，从而建立钴、镍2种元素化学形态的分离分析方法。以胎牛血清为例，详细研究了仪器工作条件的优化、沉淀剂种类及用量的选择、测定方法准确度的考察和测定方法的精密度及检出限。结果表明，该方法钴、镍的相对标准偏差分别为4.5%和2.5%，加标回收率分别为84%～98%和91%～94%，检出限分别为6.36，8.60 μg/L，测定结果可靠。

石墨炉原子吸收；胎牛血清；钴；镍；化学形态

随着医学事业的发展及病理学研究的日益深入，微量元素与生物体健康之间关系的研究不断有新发现，很多疾病都与生物体内微量元素的比例失调有关。

钴、镍均为生物体必需的微量元素，对生物体的细胞代谢、生物合成及生理功能起着重要的作用，并可以对内分泌功能等产生影响［1-3］。因为不同微量元素的化学形态生物效应差别很大，它们决定了元素在生物体内的化学行为，表现不同的效应。因此，对微量元素作用的研究，不仅要对其总量进行分析，更重要的是对微量元素存在形态进行研究。然而，目前医学领域对机体内微量元素的研究主要集中于总量的测定，对生物体内微量元素不同的化学形态研究还很少。原子吸收光谱法虽是测定微量元素应用最广泛的方法，但应用原子吸收光谱法测定血清中不同化学形态的钴、镍还未见报道。

对微量元素测定，可应用火焰原子吸收光谱法和石墨炉原子吸收光谱法。因血清中钴、镍含量均较低，所以本文利用石墨炉原子吸收光谱法灵敏度高、取样量少的优点，测定血清中的钴、镍含量。通过对血清中钴、镍2种元素不同形态测定方法的研究，建立了生物体内结合态与非结合态微量元素Co和Ni测定的方法，能为探索这些微量元素与生物体的健康关系提供更多的信息，进而为Co和Ni所导致一些疾病的治疗提供帮助。

1　试验部分

1.1试剂及仪器

浓硝酸（分析纯），TritonX-100；无水乙醇（分析纯），0.2%TritonX-100和硝酸混合液（取1.0 mLTritonX-100和1.0 mL硝酸，用水稀释到500 mL容量瓶中）；Co和Ni的标准溶液（储备液为1 g/L）；胎牛血清，郑州佰安生物工程有限公司提供；SPDUO 240FS/240Z型原子吸收光谱仪，美国瓦里安公司产品；H2500R-2型离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.2试验过程

1.2.1样品处理

（1）血清中Co和Ni总量。取-20℃环境下保存的血清样品2.5 mL于25 mL容量瓶中，用0.2% TritonX-100和硝酸的混合液定容。

（2）血清中非结合态Co和Ni含量。取1支聚乙烯试管，加入0.8 mL胎牛血清，4.8 mL无水乙醇，2.4 mL混合溶液。静置一夜后于转速15 000 r/min下离心，温度4℃，时间10 min。连续离心2次，以保证离心充分。上层清液，即制备的血清样品中元素的非结合态样品溶液。

1.2.2仪器工作条件

波长240.8 nm，通带0.2 nm，灯电流10 mA，氩气流量200 mL/min，原子化阶段停气。石墨炉Co升温程序的为干燥（85℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（963℃，5s）、原子化（2 459℃，5 s）、除残（2 800℃，3 s），Ni的升温程序为干燥（85℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（1 021℃，5 s）、原子化（2 292℃，5 s）、除残（2 800℃，3 s）。

2　结果与讨论

2.1干燥条件优化

移取2.5 mL胎牛血清至25 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，将其作为母液。用1%TritonX-100和硝酸混合液稀释成0.2%的溶液作为制备液（把2种溶液分别放在自动进样器样品盘的相应位置，分析时自动进样装置会将上述2种溶液按一定比例混合，组成与样品基体的黏度、表面张力大致相同的溶液，以便较准确考察干燥时的情况。），然后在仪器软件的引导下（第1步，85℃，5 s；第2步，95℃，40 s；第3步，120℃，10 s）进行干燥。通过石墨炉视频画面观察干燥的效果，发现在给定的干燥温度及时间下，溶剂可以完全蒸发，灰化时无液体飞溅现象，所以仪器软件引导下的干燥步骤、温度和时间是合适的。

2.2灰化和原子化温度及时间

取适量Co和Ni的标准溶液，逐级稀释至质量浓度为20 μg/L，作为母液。移取20 mL混液至100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，作为制备液。利用仪器的表面响应动力学向导可得到Co2+和Ni2+灰化和原子化温度及时间的优化程序，在该程序下仪器自动测定工作，并给出测定结果和优化图。

Co2+灰化和原子化温度及时间的优化结果见图1，Ni2+灰化和原子化温度及时间的优化结果见图2。

图1　C o2+灰化和原子化温度及时间的优化结果

图2　N i2+灰化和原子化温度及时间的优化结果

根据图1，仪器自动给出Co的最佳工作条件为灰化温度963℃，原子化温度2 459℃。根据图2，Ni的最佳工作条件为灰化温度1 021℃，原子化温度2 292℃。

2.3沉淀剂的选择

结合态与非结合态测定结果的准确度在一定程度上取决于蛋白质的分离状况，选择合适的沉淀剂是非常重要的。目前，蛋白质的沉淀主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐析法、生物碱试剂和某些酸沉淀法以及加热变性沉淀法等。

血清中Co的存在形式主要有与生物大分子结合的生物金属和自由离子，即结合态与非结合态。使用蛋白沉淀剂把血清中的蛋白沉淀，结合态的微量元素随蛋白质进入沉淀中，上清液中剩下的元素即为非结合态。如果采用盐析法、重金属盐析法、生物碱试剂和某些酸沉淀法、加热变性沉淀法，都会向样品中引入其他元素，从而给测定带来不可预知的影响。所以，本试验选用有机溶剂沉淀法，因甲醇与丙酮毒性均比乙醇大，故而乙醇是较为理想的沉淀剂。同时，由文献［4］可知乙醇低温沉淀蛋白法不仅完全且温和，对结合态的元素影响较小，且取材容易、操作简单、成本低廉、耗时短、可重复性好。因而，本试验选用乙醇作为沉淀剂。

2.4沉淀剂用量的选择

取4支具塞聚乙烯试管，编号为1，2，3，4，分别加入0.80 mL血清样品，依次加入乙醇4.00，4.40，4.80，5.20 mL，加水定容至8.00 mL，使乙醇体积分数一次达到50%，55%，60%，65%，血清浓度均为10%。

静置一夜后，用湘仪离心机进行离心，条件为转速15 000 r/min，温度4℃，时间10 min，连续离心2次，以保证离心充分。取上层清液，用石墨炉在优化条件下测定Co和Ni的含量。因乙醇中本身含有少量的Co和Ni，需测定空白乙醇中2种元素的含量。

胎牛血清中Co和Ni的含量见表1。

表1　胎牛血清中C o和N i的含量/μg·L-1

由表1可知，对于Co而言，乙醇体积分数为60%时，分离结合态与非结合态的效果最好。因而，本试验采用60%乙醇为沉淀剂分离血清，测定非结合态中Co的含量。对于Ni而言，测定结果均为负值，分析发现原因主要为无水乙醇中Ni含量太高，经蒸馏后仍无法消除，使背景吸收较大，而胎牛血清中Ni含量本就较低，致使元素Ni的测定不准确。

2.5工作曲线

分别配制Co和Ni的标准溶液，使其质量浓度分别达到0，3.00，6.00，9.00，15.00 μg/L，测定其吸光度，绘制标准曲线。对空白样品低质量浓度加标试验，按照样品处理方法平行分析7份空白加标样品，根据标准偏差计算Co和Ni的方法检出限。

Co和Ni的标准曲线与方法检出限见表2。

表2　C o和N i的标准曲线与方法检出限

2.6方法的加标回收率和精密度

Co和Ni的回收率及相对标准偏差见表3。

在空白样品中，加Co和Ni标准溶液，按照样品处理方法处理后用原子吸收进行测定。平行测定7次，得到Co和Ni的回收率及样品结果的相对标准偏差。方法回收率和精密度满足样品分析要求。

表3　C o和N i的回收率及相对标准偏差

2.7胎牛血清中Co和Ni含量测定

按照试验优化过的样品前处理和测定参数对样品进行测定，胎牛血清中结合态Co的含量=血清中Co的总含量-非结合态Co的含量。

血清中不同形态Co和Ni的测定结果见表4。

表4　血清中不同形态C o和N i的测定结果/μg·L-1

3　结论

本试验通过配制合适质量浓度的母液，利用石墨炉的表面响应动力学向导，优化Co和Ni的工作条件；选用乙醇作为沉淀剂，通过测定不同体积分数乙醇下血清分离情况，得出乙醇体积分数为60%时分离效果最好。在优化条件下，测定血清中Co和Ni含量及非结合态10%血清中元素含量，通过差减法求出结合态元素含量。结果表明，Co的RSD为4.5%，回收率在84%～98%；Ni的RSD为2.5%，回收率91%～94%，方法可靠，结果较为可信，为探索这些微量元素与生物体的健康关系提供更多的信息，进而为Co和Ni所导致一些疾病的治疗提供帮助。

［1］汪红梅.过敏性鼻炎患者血清中铬钴镍钒钼含量的研究 ［J］.内蒙古医学杂志，2008，40（1）：102-103.

［2］苗懿德，刘杰，刘晓瑞.健康老年人与糖尿病患者血清10种元素测定比较 ［J］.微量元素与健康研究，2001，18（3）：23-24.

［3］刘巨涛，朱志国，年瑞华，等.中老年糖尿病轻重度患者血清中的铁铬钴镍 ［J］.光谱学与光谱分析，2000，20（1）：87-88.

［4］胡军，常耀明，高双斌.原子吸收光谱法测定血清中不同化学形态的铜铁锌 ［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（3）：700-703.◇

Determination of Different Chemical Form of Co and Ni in Fetal Bovine Serum by Atomic Absorption Spectrometry

YANG Huihui，ZHOU Zhiqiang，HAN Erfang，WANG Juan，LIU Xin
（He'nan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou，He'nan 451450，China）

Separate cobalt and nickel in the serum into the forms of combination and non-combination by the use of ethanol at low temperature（4℃） protein precipitation method.Because the sensitivity of GFAAS is high and the sampling is low，this study uses it to analysis the total amount of Co and Ni in serum and the amount of the forms of non-combination.The amount of the forms of combination of Co and Ni is obtained by calculation，so as to establish two chemical forms of Co and Ni separation element analysis method.Take fetal bovine serum for example，a detailed study are as follow：working conditions for the choice of instruments，the type and amount of precipitation agent of choice，determination of the accuracy of the inspection，determination of precision and seizure the limited.The results show that the cobalt and nickel，respectively，the relative standard deviation of 4.5%and 2.5%，and recovery are 84%～98%and 91%～94%，respectively，the detection limit 6.36，8.60 μg/L.The result is accurate and reliable.

GFAAS；fetal bovine serum；cobalt；nickel；chemical form

P618.63

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.018

1671-9646（2016）07a-0059-03

2016-04-12

杨会会（1987— ），女，硕士，助教，研究方向为食品与环境分析。