毛明光，温施慧，姜志强，蒋洁兰，孙　航，吕绘倩，李　幸

（大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室，辽宁大连116023）



太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白（CP）的原核表达及条件优化

毛明光，温施慧，姜志强，蒋洁兰，孙航，吕绘倩，李幸

（大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室，辽宁大连116023）

摘要：为深入研究太平洋鳕Gadusmacrocephalus神经坏死病毒 （Pacific cod nervous necrosis virus，PCNNV）衣壳蛋白 （capsid protein，CP）的功能，将PCNNV cp基因连接到pET-32a原核表达载体中，构建原核表达重组载体pEVCP，将其转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）表达系统中进行融合表达，对诱导剂 IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化，采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明：本研究中成功构建了重组载体pEVCP，表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000；目的蛋白经质谱鉴定，有6个肽段的氨基酸序列与预期一致；对重组菌株pEVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。

关键词：太平洋鳕；神经坏死病毒；衣壳蛋白；原核表达

太平洋鳕Gadusmacrocephalus俗称大头鳕，隶属于鳕形目 Gadiformes、鳕科 Gadidae、鳕属 Gadus，属冷水性底层鱼类。太平洋鳕是中国北方乃至世界重要的海洋经济鱼类之一，近年来，由于过度捕捞以及环境污染等使其产量大幅降低。因此，太平洋鳕的人工育苗与增养殖技术问题亟待解决。目前，农业部北方海水增养殖重点实验室研究人员［1-4］已经成功进行了太平洋鳕的人工繁育和周年饲养。但育苗早期会出现鱼苗大量死亡的现象，仔、稚鱼出现上浮于水面、急促螺旋状游动等典型的神经疾病症状，与其他鱼类感染诺达病毒 （Nodavirus）的症状相似，经显微镜观察及分子生物学诊断，确诊为鱼类病毒性神经坏死病 （viral nervous necrosis，VNN）［5］。

VNN又被称为视网膜病及病毒性脑病 （viral encephalopathy and retinopathy，VER），该病被世界动物卫生组织 （OIE）［6］列为重要的鱼类病害，是世界性鱼类流行性传染病。该病的病原为β型诺达病毒，主要感染水产动物的神经系统，造成病毒性神经坏死，故该病毒也被称为神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV）。目前，NNV已在鳗鲡目Anguilliformes、鲈形目Perciformes、鲽形目Pleuronectiformes、鲀形目 Tetraodontiformes、鳕形目Gadiformes等40多种鱼类中发现，其影响蔓延至亚洲、欧洲、澳洲和北美洲，给各国海水养殖业造成了巨大的损失［7-9］。但对VNN病还没有特效治疗药物，考虑到化学药物和抗生素的使用已受到限制，以及环境和食品的安全，VNN病目前还以预防为主。防治VNN等病毒性传染病最有效的途径之一是研制特异性疫苗，该疫苗的抗原即为病毒衣壳蛋白 （capsid protein，CP）。由于传统的灭活天然病毒和弱毒疫苗在安全性等方面存在问题，而病毒的细胞培养技术亦尚未成熟，因此，基因工程疫苗作为新型疫苗是未来研究和发展的方向。

NNV基因组由2条非聚腺苷酸化、正义的RNA1和RNA2单链构成［10］，RNA1主要编码非结构A蛋白，是依赖RNA的聚合酶；RNA2编码病毒CP，其序列大小为1300～1400 bp［11］。作者的前期研究结果显示，冷水性和暖温性鱼类中NNV基因组存在明显差异［5］。目前，暖水性鱼类NNV病毒疫苗已经开始研制［12］，而冷水性鱼类病毒疫苗的研究尚未见报道。本研究中，根据太平洋鳕神经坏死病毒 （Pacific cod nervous necrosis virus，PCNNV）衣壳蛋白 （CP）基因的核苷酸序列 （Genbank登录号：KM576685），构建重组表达载体pEVCP，将其转化至表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，优化重组蛋白诱导表达条件，以期为后续研制冷水性鱼类病毒疫苗和开发病毒快速检测试剂盒奠定基础，为成功实现太平洋鳕人工繁育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体 从含有PCNNV RNA2核苷酸序列完整开放阅读框 （open reading frame，ORF）的克隆菌株中提取质粒，命名为pMD-NNV，由农业部北方海水增养殖重点实验室提供；克隆菌株E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体 pET-32a和表达菌株 E.coli BL21 （DE3）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 LA Taq聚合酶、NcoⅠ和NotⅠ限制性内切酶购自宝生物工程 （大连）有限公司；T4 DNA连接酶购自New England Biotech（北京）有限公司；QIAquick Gel Extraction胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；氨苄青霉素 （Amp）购自生工生物工程 （上海）股份有限公司；诱导剂IPTG、EasyPure PlasmidMiniPrep质粒提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder和 2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白Ladder购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的 PCR扩增与回收 根据 PCNNV cp基因序列特点和pET-32a表达载体上的NcoⅠ和NotⅠ酶切位点，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物：

其中，限制性内切酶的酶切位点用下划线表示，终止密码子前引入的组氨酸 （His）标签序列用方框表示。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

以pMD-NNV质粒为模板，F1和R1为上、下游引物，扩增病毒CP编码区。PCR反应体系 （共20.0μL）：灭菌双蒸水9.6μL，10×LA Taq Buffer Ⅱ （Mg2+Plus） 2.0μL，dNTPMixture（2.5 mmol/L each）3.2μL，上、下游引物 （终浓度1.0μmol/L）各2.0μL，pMD-NNV质粒1.0μL，LA Taq（TaKaRa）（5 U/μL）0.2μL。PCR反应条件：94℃下预变性3min；94℃下变性30 s，56℃下退火1 min，72℃下延伸90 s，共进行30个循环；最后在72℃下再延伸10 min。产物用琼脂糖凝胶进行电泳，并回收纯化特异性片段，参照QIAquick凝胶试剂盒使用说明书方法进行。

1.2.2 重组表达载体pEVCP的连接和转化 将上述纯化的目的片段和pET-32a表达载体分别用NcoⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行双酶切，用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率并回收纯化酶切后的目的片段和载体。用T4连接酶将回收后具有相同NcoⅠ和NotⅠ黏性末端的载体和目的基因片段按摩尔比为1∶5进行连接。反应体系 （共20.0μL）：10×T4 Buffer2.0μL，载体pET-32a 3.0μL，目的基因DNA 4.6μL，T4 DNA Ligase 1μL，用RNasefree H2O补足至总体积20μL。在25℃条件下水浴40 min，连接产物即为构建的重组表达载体 pEVCP。将pEVCP转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp（100μg/m L）的LB琼脂平板上，于37℃下倒置过夜培养。

1.2.3 重组表达载体pEVCP的筛选与鉴定 采用PCR法快速鉴定阳性克隆，将扩增片段大小符合的菌液送至英潍捷基 （上海）贸易有限公司进行测序。经测序检测无误后的菌液，按北京全式金质粒提取试剂盒说明书抽提质粒。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达与质谱鉴定 向表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态细胞中转入上述pEVCP质粒，得到含重组基因的原核重组菌，命名为pEVCP/BL21，涂布于LB琼脂平板 （含100 μg/mL Amp、0.5％葡萄糖）上，于37℃下培养过夜。挑取单克隆菌株，接种于20 mL LB培养基（含100μg/m L Amp）中，于37℃、200 r/min摇床上培养至OD600nm值为0.6～1.0。按1∶50比例把菌液再转移至新鲜 LB培养基 （含 100μg/mL Amp）中继续培养3～4 h，当OD600nm值约为0.6时停止培养。留出部分菌液不加诱导剂作为对照组，剩余菌液加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG，培养3 h。分别收集有无诱导剂的菌液1mL，以5000×g离心5 min，弃去上清液，用100 μL pH为8.0的PBS充分悬浮菌体，然后加入1× SDS上样缓冲液，再煮沸5～10 min，以12 000 r/min离心5 min，用SDS-PAGE电泳检测上清液，确认菌体目的蛋白是否表达。并将诱导表达的目的条带切胶送至生工生物工程 （上海）股份有限公司采用Maldi-TOF-TOF法进行质谱鉴定。

1.2.5 重组菌株pEVCP/BL21原核表达条件的优化

（1）诱导剂IPTG浓度的优化。将扩大培养的菌液分装于8个50 mL锥形瓶中，每瓶分装10 mL，先留出1瓶不做任何处理，作为空白对照。剩余7瓶再取1瓶不加IPTG，其余分别加入终浓度为0.01、0.1、0.5、1、3、5 mmol/L的诱导剂IPTG，将上述7瓶菌液分别在28℃、180 r/min摇床上培养3 h。取样进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白表达量。

（2）诱导时间的优化。将扩大培养的菌液分装于7个50 mL锥形瓶中，每瓶分装10 mL，先留出1瓶不做诱导表达，剩余各瓶菌液加入诱导剂IPTG，使其终浓度为 1 mmol/L，在 28℃、180 r/min摇床上分别培养1、2、3、4、5、6 h。取样进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白表达量。

（3）诱导温度的优化。将扩大培养的菌液分装于7个50 mL锥形瓶中，每瓶分装10 mL，先留出1瓶不做诱导表达，剩余各瓶菌液加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1 mmol/L，在180 r/min摇床上培养3 h，培养温度分别为22、26、28、30、34、37℃。取样进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白表达量。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体pEVCP的构建与鉴定

以F1和R1为上、下游引物，pMD-NNV质粒为模板，进行PCNNV cp基因的扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增出一条1000 bp左右的条带（图1-A），条带大小与预期相符，表明PCR扩增出了目的片段。

将pET-32a表达载体和纯化的目的片段分别用NcoⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行双酶切。酶切前的pET-32a质粒为环状 （图1-B），NcoⅠ和NotⅠ限制性内切酶在质粒上的位点仅相差46 bp，故酶切后的片段在5000 bp左右 （图1-C），与实际大小相符。扩增目的片段的引物酶切位点在两端，故酶切后片段大小几乎不变，仍为1000 bp（图1-D）。

重组表达载体pEVCP经转化、涂板、PCR鉴定，得到阳性克隆片段长度约1600 bp（图1-E），与预期相符。测序结果与已知PCNNV cp基因ORF的序列一致，表明重组表达载体pEVCP构建成功。

注：M1为1 kb DNA Ladder；M2为DL2000 DNA Marker；1为PCNNV cp基因扩增产物；2为酶切前的pET-32a质粒；3为pET-32a经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后的产物；4为PCNNV cp经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后的产物；5、6、7、8分别为pEVCP重组表达载体阳性克隆Note：M1，1 kb DNA Ladder；M2，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification of PCNNV cp gene；2，plasmid pET-32a；3，plasmid pET-32a digested with NcoⅠand NotⅠ；4，PCNNV cp gene digested with NcoⅠand NotⅠ；5，6，7，8，postive clone of pEVCP图1　重组表达载体pEVCP的构建与鉴定Fig.1 Construction and identification of recombinant vector p lasm id pEVCP

2.2 重组蛋白的诱导表达与质谱鉴定

SDS-PAGE电泳检测结果显示，与对照组相比，pEVCP/BL21经IPTG诱导后在蛋白相对分子质量为55 000处出现特异性表达，与预期相符（图2）。

切取目标条带进行质谱检测，采用Mascot与NCBInr数据库进行搜索和对比，结果显示，目标蛋白酶解的肽段中有7个肽段归属于一个蛋白，这些肽段的序列与数据库中大西洋鳕Gadusmorhua NNV CP的序列相匹配，其中有4个肽段的可信度单独超过阈值分数，这些匹配的肽段序列在其蛋白序列中覆盖度为24％。上述7个肽段中有6个肽段的序列与太平洋鳕NNV基因推导的氨基酸序列完全匹配 （图3），肽段与其在推导氨基酸序列中的位置见表1。由此可见，SDS-PAGE胶上的特异性表达带为重组衣壳蛋白。SDS-PAGE和质谱鉴定结果表明，PCNNV cp基因在重组菌BL21中得到了正确表达。

注：M为蛋白Ladder；1为未经诱导的pEVCP/BL21全菌蛋白；2为经1 mmol/L IPTG诱导3 h的全菌蛋白 （箭头所示为重组目的蛋白条带）Note：M，protein Ladder；1，non-induced sample；2，protein expression induced by 1 mmol/L IPTG for 3 h图2　重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达Fig.2 Expression of recombinant capsid protein in Escherichia coli BL21（DE3）

注：标有核质比的6个峰表示检出的与太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白相匹配的肽段Note：The peaksmarked with mass corresponded to the 6 peptides which match with PCNNV CP图3　重组蛋白的质谱鉴定Fig.3 M ass spectrum of the recom binant capsid protein

表1　与推导的太平洋鳕神经坏死病毒氨基酸序列相匹配的肽段序列及位置Tab.1 　Sequences and locations of the peptides which match w ith the deduced am ino acid sequence of PCNNV CP

2.3 重组菌株pEVCP/BL21诱导条件的优化

2.3.1 诱导剂IPTG浓度 重组菌株pEVCP/BL21

经诱导剂诱导后目的蛋白具有明显的表达。不同浓度IPTG对蛋白表达量的影响结果如图4所示，空白对照组 （未经处理）和未添加IPTG培养3 h组的菌液中目的蛋白均未出现明显的表达，未添加IPTG的菌液经28℃下培养3 h后，仅在浓度上明显比空白对照组大，其余IPTG浓度菌液中目的蛋白均出现大量的表达，除0.01 mmol/L组目的蛋白的表达量相对较少外，其他高诱导剂浓度组目的蛋白表达量差异不明显，但除目的蛋白以外的蛋白条带的颜色随IPTG浓度升高而变浅，推测加入过量的诱导剂可能会导致细胞死亡。因此，诱导剂IPTG的最佳添加浓度为0.1 mmol/L。

注：M为蛋白Ladder；1为空白对照组；2为未添加IPTG的培养组；3～8分别为重组菌pEVCP/BL21在0.01、0.1、0.5、1、3、5 mmol/L IPTG诱导剂浓度下的表达Note：M，protein Ladder；1，blank control；2，pEVCP/BL21 cultured without addition of IPTG；3-8，expression of pEVCP/BL21 induced by 0.01，0.1，0.5，1，3 mmol/L and 5 mmol/L IPTG，respectively图4　诱导剂IPTG浓度对pEVCP/BL21表达影响的SDS-PAGEFig.4 Expression of pEVCP/BL21 induced by different IPTG concentrations analyzed by SDS-PAGE

2.3.2 诱导时间 不同诱导时间 （1、2、3、4、5、6 h）对蛋白表达量的影响结果如图5所示，目的蛋白在诱导1 h后即开始表达，且在1～3 h时表达量随诱导时间的增加而增多，3 h后表达量趋于稳定。因此，最佳诱导时间为3 h。

注：M为蛋白Ladder；1为pEVCP/BL21未诱导；2～7分别为重组菌在1、2、3、4、5、6 h诱导时间下的表达Note：M，protein Ladder；1，blank control without induction by pEVCP/BL21；2-7，expression of recombinantbacteria induced for 1，2，3，4，5 h and 6 h，respectively图5　诱导时间对 pEVCP/BL21表达影响的 SDSPAGEFig.5 Expression of pEVCP/BL21 induced for differen t hours analyzed by SDS-PAGE

2.3.3 诱导温度 不同诱导温度 （22、26、28、30、34、37℃）对目的蛋白表达量的影响如图6所示，在22～30℃时，目的蛋白的表达量随温度的升高而增多，表达量最高值出现在30℃，高温组 （34℃和37℃）蛋白表达量与30℃组无明显差异，但温度过高时杂蛋白的量增多。因此，最适诱导温度为30℃。

注：M为蛋白Ladder；1为pEVCP/BL21未诱导；2～7分别为重组菌在22、26、28、30、34、37℃诱导温度下的表达Note：M，protein Ladder；1，blank control without induction by pEVCP/BL21；2-7，expression of recombinant bacteria induced at 22，26，28，30，34℃ and 37℃，respectively图6　诱导温度对 pEVCP/BL21表达影响的 SDSPAGEFig.6 Expression of pEVCP/BL21 induced at different temperature analyzed by SDS-PAGE

对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度条件优化的结果表明，以上条件对重组载体的原核表达均有影响。通过对目的蛋白含量的分析 （图4～图6），得出IPTG对重组菌株pEVCP/BL21的最佳诱导条件：IPTG浓度为0.1 mmol/L、时间为3 h、温度为30℃。

3 讨论

诺达病毒科可分为主要感染昆虫的α诺达病毒属以及主要感染鱼类的β诺达病毒属。β诺达病毒直径仅为25～30 nm，是迄今发现的最小鱼类病毒［13］。根据25种β诺达病毒的外壳蛋白基因序列，鱼类NNV可分为4种基因型：赤点石斑鱼神经坏死病毒 （redspotted grouper NNV，RGNNV），红鳍东方鲀神经坏死病毒 （tiger puffer NNV，TPNNV），条斑星鲽神经坏死病毒 （barfin flouder NNV，BFNNV），黄带鲹神经坏死病毒 （stfiped jack NNV，SJNNV）［14］。目前，在中国所报道的NNV均属于RGNNV。β诺达病毒衣壳蛋白含有大量抗原表位，据报道，试验表达出的重组蛋白具有良好的抗原特异性，可诱导宿主产生抗体并起到保护作用［15-18］，因此，可通过体外表达 NNV CP研制抗病毒疫苗。NNV CP复制所依赖的聚合酶校正能力弱而易导致突变，故不同宿主针对NNV会产生不同的细胞表面受体表位。基于NNV的这一特点，为了提高保护效率必须研制有针对性的疫苗［19］。本实验室在前期工作中已获得太平洋鳕NNV RNA2核苷酸序列，并将该序列与β诺达病毒属其他几种病毒的cp核苷酸序列进行分子进化分析，得出太平洋鳕NNV病毒株是BFNNV血清型的成员。为了深入研究太平洋鳕NNV cp基因的功能及研制有效疫苗，本研究中将其基因重组到表达载体pET-32a中，并转化至大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）原核表达系统中，成功地表达了重组蛋白。

3.1 表达系统与表达载体的选择

为了获得高表达量的重组蛋白，通常需要建立基因的高效表达系统。目前，常用的蛋白表达系统有哺乳动物细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统和原核表达系统 （大肠杆菌E.coli表达系统）。其中，大肠杆菌表达系统具有遗传背景研究较透彻、细胞繁殖快速、培养周期短和产量高等优点，已成为高效表达的首选体系［20］。截至2009年，美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局所批准的生物制药中，大肠杆菌作为表达宿主以重组蛋白的药品占29.8％［21］。而在表达NNV cp基因的相关报道中，迄今为止，只有罗卫等［22］将青石斑鱼 NNV cp基因插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统，在昆虫细胞中进行表达，其余的以采用原核表达系统的居多［15-16，23］。从目的蛋白应用的因素考虑，尽管将大肠杆菌表达的蛋白用于体内时，具有缺乏转译后修饰、有内毒素和重组蛋白空间构象改变的缺点，但蛋白自然空间构象对制备多克隆抗体血清并不起决定性作用，故本研究中采用大肠杆菌 BL21（DE3）来表达重组蛋白。

表达系统的核心是表达载体，在大肠杆菌表达外源基因时，pET载体系统是目前最理想的原核载体之一，其优点除了表达量高外，还可增加表达产物的稳定性和免疫原性，更利于表达产物的有效回收与纯化［24］。大肠杆菌载体的表达分为非融合型表达、融合型表达和分泌型表达3种［25］。本试验中，采用的 pET-32a属于大肠杆菌融合型表达中的纯化标签融合系统，将His标签置于表达载体中表达，使蛋白的检测和纯化更为容易，且pET-32a原核表达载体已经被广泛商用，重组蛋白的应用门槛较低。PCNNV cp基因编码的蛋白相对分子质量理论大小为37 000，但因插入pET-32a的目的基因和载体自身带的一段编码硫氧还蛋白的序列及6 个His标签序列 （相对分子质量为18 300的多肽）一起融合表达，因此，表达产物的相对分子质量是三者之和，约为55 000。

3.2 诱导条件的优化

影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素，除了载体类型、宿主菌特征之外，还包括营养状况和培养条件等。即使用相同的原核表达体系也会有完全不同的外源蛋白诱导条件，故优化对应的诱导条件是提高外源蛋白表达量的必要途径［26-27］。本试验中，诱导剂浓度为0.1 mmol/L时蛋白的表达量已达到最高值，随着IPTG浓度继续升高，目的蛋白的表达量无显著变化，但其他蛋白的表达量却出现降低，可能是由于诱导剂对大肠杆菌代谢的毒性作用增强［20］。诱导时间为3 h时，目的蛋白的表达量达到最大，且不再随着诱导时间的延长而增加。温度在诱导过程中可能会影响酶的活性和氧的溶解度，本试验中，诱导温度升至30℃时目的蛋白表达量已达到最高，高温 （34、37℃）下蛋白表达量与30℃时无明显差异，且温度过高不仅杂蛋白比例升高，还会使一些蛋白累积形成包涵体。从经济、时间角度考虑，本研究中重组菌pEVCP/BL21表达融合蛋白的最适条件为：IPTG终浓度 0.1 mmol/L、诱导时间3 h、诱导温度30℃。

3.3 重组蛋白的鉴定

对于基因工程中表达动物蛋白的检测方法，蛋白质谱鉴定是基于Western blot和Elisa传统检测方法基础上的新兴检测技术。采用质谱鉴定中MALDI-TOF-TOF测得肽指纹图谱的方式鉴定蛋白质，是目前蛋白质组学研究中普遍应用的方法［28］。进一步质谱检测SDS-PAGE胶上特异条带结果显示，获得的6个肽段的氨基酸序列与太平洋鳕NNV cp基因推导的氨基酸序列完全匹配，证明该基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中获得了成功表达。

综上所述，本研究中将太平洋鳕NNV cp基因成功导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经过优化得出PCNNV CP蛋白的最佳表达条件。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。

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Prokaryotic expression and condition optim ization of nervous necrosis virus capsid protein（CP）in Pacific cod Gadusmacrocephalus

MAO Ming-guang，WEN Shi-hui，JIANG Zhi-qiang，JIANG Jie-lan，SUN Hang，LÜHui-qian，LIXing
（Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Fish Applied Biology and Aquaculture in North China，Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Capsid protein（CP）gene of nervous necrosis virus in Pacific cod Gadusmacrocephalus（PCNNV）was inserted into plasmid pET-32a to construct recombinant plasmid pEVCP to further study the function of PCNNV CP，and to devise an effective vaccine for PCNNV.The recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21（DE3），and then induced under conditions of different IPTG concentrations，time and temperature.The expressed products were identified by SDS-PAGE and mass spectrum analysis.Results showed that the recombinant plasmid pEVCP was constructed successfully and a protein with molecular weight of 55 000 was identified using SDS-PAGE.6 peptide segments of recombined CPwere sequenced correctly usingmass spectrum.The expression levelwas varied under different induced conditions，with the optimal expression under conditions of 0.1 mmol/L IPTG，3 h and 30℃.The findings would contribute to exploration of nervous necrosis virus（NNV）vaccine and development of rapid detection kit for NNV.

Key words：Gadusmacrocephalus；nervous necrosis virus；capsid protein；prokaryotic expression

中图分类号：Q786

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.001

文章编号：2095-1388（2016）02-0117-07

收稿日期：2015-06-04

基金项目：国家自然科学基金资助项目 （31302202）；国家 “863”计划项目 （2012AA10A413）；农业部北方海水增养殖重点实验室开放课题 （2014-MSENC-KF-12）；辽宁省教育厅科研项目 （L2013276）

作者简介：毛明光 （1982—），男，博士，副教授。E-mail：mmg@dlou.edu.cn

通信作者：姜志强 （1960—），男，教授。E-mail：zhqjiang@dlou.edu.cn