范青松，邢　坤，刘海映，孙静娴，陈　雷，刘　奇

（1.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁大连116023；2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁大连116023）



口虾蛄脑部褐脂质分布、组织学和超微结构特征研究

范青松1，邢坤1，刘海映1，孙静娴2，陈雷1，刘奇1

（1.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁大连116023；2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁大连116023）

摘要：为了解口虾蛄Oratosquilla oratoria脑部形态特征，揭示口虾蛄生理年龄与褐脂质 （lipofuscin）含量的关系，采用组织切片、荧光成像和透射电镜技术，研究了口虾蛄脑中褐脂质的形态、分布和超微结构特征。结果表明：口虾蛄脑位于眼节之后、头脑甲最前方，体积较小；H.E组织切片下脑部细胞核颗粒呈圆形且均匀分布，直径为10～30μm，并在脑前桥细胞团 （protocerebral bridge cellmass）区域分布较多；荧光显微镜下褐脂质颗粒呈黄褐色，直径为1～3μm，均匀分布于脑部；透射电镜下可见褐脂质颗粒多聚集分布于近细胞核区域，外被单层细胞器膜，染色密度较其他区域高且均匀。研究表明，整体上口虾蛄脑部褐脂质分布均匀，其形态与其他甲壳动物脑部褐脂质相似。

关键词：口虾蛄；脑；褐脂质；超微结构

口虾蛄Oratosquillaoratoria隶属于节肢动物门Arthropoda、甲壳纲Crustacea、口足目Stomatopoda、虾蛄科Squillidae、口虾蛄属Oratosquilla［1］，是常见的海产经济动物，为底栖穴居虾类。口虾蛄是中国沿海重要的甲壳类动物之一，从黄、渤海向南至南海，在香港周边海域和北部湾均有发现。口虾蛄是中国近海重要的渔业资源，国内对口虾蛄繁殖的生物学特征进行了大量研究［2-4］。近年来，随着捕捞强度的加大，研究人员对口虾蛄的分布和渔业资源特征进行了调查分析［5-6］，结果表明，口虾蛄常为沿海底栖生物群落中的优势种，是重要的经济物种。目前，对十足类甲壳动物脑部组织结构的研究较多［7-8］。Stegner等［9］对马蹄虾 Hutchinsoniella macracantha脑部形态进行了分析研究，明确了脑部系统神经三维立体结构；Fanenbruck等［10］研究发现，甲壳动物桨足纲Remipedia脑部不同组织结构与其系统生长发育有关；Kodama等［11-12］研究表明，口虾蛄脑部及其褐脂质分布与组成规律可用于种群年龄组成鉴定，但对口虾蛄脑部褐脂质超微结构的研究尚未见报道。本研究中分析了口虾蛄脑部组织中褐脂质的形态、分布和超微结构特征，以期利用褐脂质作为年龄参照物准确鉴定口虾蛄年龄结构 （age structure），开展口虾蛄种群生态学研究，阐明口虾蛄资源生物学特征，为开发与利用口虾蛄资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验样品为2014年6月采自辽宁省渤海海域的野生群体口虾蛄，共20只，不分雌雄，体长为（12.69±0.7）cm，体质量为 （19.93±3.54）g。

1.2 方法

1.2.1 光学显微镜观察 取口虾蛄脑部组织采用Bonin氏液固定，用梯度酒精 （50％、70％、80％、90％、95％、100％）脱水后包埋，采取水平及纵向切片，厚度为6μm，用苏木精、伊红染色，并使用Nikon 50i型光学显微镜观察。1.2.2 荧光显微镜观察 取口虾蛄脑部活体组织，直接在梯度酒精（70％、80％、90％、95％、100％）下脱水后包埋，采取水平及纵向切片，厚度为6μm，在Olympus BX51荧光显微镜下直接观察，激发光波长为580 nm，观察时波长为488 nm。1.2.3 透射电镜观察 在解剖镜下从口虾蛄头脑部背部完整取出口虾蛄脑，置于2.5％戊二醛 （用pH为7.2的磷酸缓冲液配制）中固定，并于冰箱（4℃）中保存过夜，然后用1％锇酸 （用pH为7.2的磷酸缓冲液配制）后固定2 h。经过梯度酒精 （50％、70％、80％、90％、95％、100％）脱水和纯丙酮转换后，用环氧树脂包埋，超薄切片，再用醋酸铀和柠檬酸铅染色，切片厚度为70 nm，采用JEM-1200EX型透射电镜 （日本电子公司）观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 组织结构

在对口虾蛄活体解剖时，可见其脑位于眼节后端之头脑甲最前缘 （图1-A），呈椭圆形，有长径、短径；肉眼可见褐脂质色素累积，颜色与周围的甲壳、肌肉组织差别明显，容易区分 （图1-B）。组织切片下 （图1-C、D），脑部神经细胞核颗粒为深色颗粒，呈圆形，直径为10～30μm，褐脂质颗粒不明显；脑组织周围分布有结缔组织和肌肉组织，起到支撑和保护脑细胞的作用；口虾蛄脑前桥细胞团 （PBCM）是神经细胞密集分布区域。荧光显微镜下，明显可见黄色的褐脂质颗粒广泛分布于口虾蛄脑中 （图1-E、F），周围结缔组织和肌内组织中未观察到褐脂质颗粒。

注：A为口虾蛄脑部位置；B为甲壳下口虾蛄脑部形态；C、D为褐脂质颗粒分布；E、F为荧光显微镜下褐脂质分布。BR示脑；M示肌肉；N示细胞核颗粒；L示褐脂质颗粒；PBCM示脑前桥细胞团Note：A，the position of brain in mantis shrimp Oratosquilla oratoria；B，the vivisection of brain；C，D，the distribution of lipofuscin in the brain；E，F，the distribution of lipofuscin under a fluorescencemicroscope.BR，brain；M，muscle；N，nuclear particle；L，lipofuscin；PBCM，protocerebral bridge cellmass图1　口虾蛄脑部形态及褐脂质颗粒分布特征Fig.1 Distribution of lipofuscin and morphology in brain ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria

注：A为口虾蛄脑细胞；B为脑细胞核周围形态；C为包被单层膜；D为褐脂质颗粒。N示细胞核；L示褐脂质；M示线粒体；PL示初级溶酶体；LY示次级溶酶体；V示囊泡；CY示细胞质；MB示细胞膜Note：A，the brain cell ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria；B，the peri-nuclei of brain cell；C，monofilm；D，the granules of lipofuscin.N，nucleus；L，lipofuscin；M，mitochondrion；PL，primary lysosome；LY，secondary lysosome；V，vasica；CY，cytoplasm；MB，cellmembrane图2　透射电镜下口虾蛄脑部形态特征Fig.2 Ultrastructural characterization of the brain in mantis shrimp Oratosquilla oratoria under a transm ission electron m icroscope

2.2 超微结构

从图2-A、B可见，在透射电镜下，可见椭圆形褐脂质颗粒，多聚集分布于近细胞核区域，与溶酶体类似，外被单层细胞器膜，染色密度较其他区域高且均匀；不同代谢累积阶段褐脂质颗粒的染色程度不同，衰老细胞中褐脂质颗粒较深。此外，细胞核周围常见分布着初级溶酶体 （PL）、次级溶酶体 （LY）、囊泡 （V）、线粒体 （M）、褐脂质颗粒（L）等。线粒体细胞被双层膜包围，内部染色程度不同，存在着较老的细胞易变性，自由基较多；初级溶酶体结构呈囊泡状，直径为0.2～0.5μm（图2-C），是一种刚刚分泌的含有溶酶体酶的分泌小泡，此时酶处于一种非活性状态，染色较浅，电镜下多不明显。次级溶酶体和褐脂质相似，包被单层膜 （图2-D），但是体积比褐脂质颗粒稍小。由于溶酶体吞噬作用导致其内部很多物质会发生降解，其中很可能包括褐脂质。

3 讨论

3.1 口虾蛄脑部褐脂质的形态结构

褐脂质是细胞代谢产物在次级溶酶体中累积形成的［13］，是一种含有脂和蛋白质的黄褐色自发荧光物质，呈颗粒状。随着动物的生长，褐脂质颗粒会在体内不断累积，尤其富集于脑部及周围神经细胞中，关于水生无脊椎动物脑部组织形态以及褐脂质结构的研究较多［14］。口虾蛄体内褐脂质颗粒主要累积于脑部，这与对其他甲壳类动物的描述一致［8］，说明脑部是研究褐脂质结构的重要部位。荧光显微镜下，口虾蛄体内的褐脂质颗粒均匀分布于脑部；电子显微镜下，褐脂质与溶酶体类似，外被单层细胞器膜，染色密度较其他区域高，边缘密度较中间区域染色较深。

口虾蛄脑部组织切片制作较难，经高浓度酒精脱水很容易变脆，80％酒精脱水时可以适当加一滴甘油，减缓组织变脆；夏季切片时，为保持蜡块硬度，可以将包埋好的蜡块置于冰箱 （4℃）中保存。由于脱水时间不当和浸蜡时温度过高导致的组织过硬，易造成切片破碎。

另外，在荧光显微镜下，在切片后未脱蜡及染色的口虾蛄脑部组织中的黄色褐脂质颗粒清晰可见，这可用于快速测定口虾蛄脑部褐脂质的含量。

3.2 口虾蛄脑部主要成分与褐脂质关系及其作用

随着动物的生长，脑部褐脂质逐渐累积，并呈密集、扩大、增厚的趋势［15］。人类脑部发育过程中，成熟的褐脂质颗粒大多会扩充至细胞质甚至相邻的细胞，核周质中大量囊泡可能形成重要的运输机制。囊泡是由单层膜所包裹的膜性结构，主要功能是实现细胞内的膜性细胞器之间的物质运输（如脂类），在神经细胞指令下可精确控制生物酶、神经递质等分子传递的时间与位置［16］。研究表明，囊泡的运输机制实现了褐脂质颗粒在细胞质中的累积，并从细胞质延伸到原生质膜，促使细胞中褐脂质颗粒逐步累积，这与人体衰老机制密不可分［17］。

褐脂质颗粒与溶酶体颗粒之间存在着显著的相关性，二者在细胞中位置接近，均包被单层膜。Terman等［15］研究褐脂质形成机制时指出，溶酶体通过吞噬作用消除细胞内代谢废物，褐脂质颗粒来自于溶酶体内部难降解物质的积累，包含褐脂质的次级溶酶体通常称作残体，这意味着它们并不积极地集成到酸性液泡中，当与其他溶酶体或者裂解酶结合时，就会集成变为酸性液泡的一部分。目前没有统一的证据表明，褐脂质在溶酶体内降解或者通过胞外分泌而消除，即使是在比较小的个体中，褐脂质颗粒也不会被完全消除。

此外，褐脂质颗粒的形成与线粒体也是密不可分的。由于细胞氧化磷酸化产生的有害氧自由基导致线粒体变性。因此，线粒体可能是褐脂质颗粒的主要来源之一［16］。透射电镜下，褐脂质与线粒体位置非常接近，线粒体可见由双层膜包被，内含染色浓度不同的嵴状结构；褐脂质颗粒染色较深且均匀，近细胞核区域染色较深，由单层细胞器膜包被。二者都与生物新陈代谢有关，且新陈代谢速率越快，线粒体和褐脂质数量也就越多。

3.3 褐脂质与甲壳动物年龄之间的关系

年龄是一个重要的生物学参数，对研究甲壳动物生物学具有重要意义。大量研究表明，褐脂质与生物年龄间存在着重要联系，褐脂质累积与年龄间存在高度的相关性，用褐脂质可以较准确地估计甲壳动物的年龄，国际上普遍采用褐脂质标志物鉴定甲壳类年龄特征［18-20］。由于甲壳动物蜕皮频率和生长率不同，传统上用体长、体质量来估计其年龄是不准确的［21］。因此，关于口虾蛄体长、体质量与年龄的关系研究大多作为一种媒介，用来比较与褐脂质作为指标估计口虾蛄年龄的准确性，研究表明，用褐脂质作为指标来估计口虾蛄年龄的方法是准确而可靠的，其结果可为研究鉴定甲壳动物年龄提供参考。

综上所述，本研究中报道了口虾蛄脑部褐脂质组织学和超微结构，发现口虾蛄脑部褐脂质形态不仅与其他甲壳动物有相似之处，也有其自身特点，如脑部褐脂质近似椭圆形，染色密度较其他区域高且均匀，初级溶酶体与囊泡结构较多。本研究结果可为口虾蛄脑部褐脂质的进一步研究提供基础资料，但有关甲壳动物口虾蛄脑部褐脂质的形成过程及其与年龄的关系有待进一步研究。

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M orphology and histology of brain and ultrastructure and distribution of lipofuscin in brain ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria

FAN Qing-song1，XING Kun1，LIU Hai-ying1，SUN Jing-xian2，CHEN Lei1，LIU Qi1
（1.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Morphology and histology of brain and ultrastructure and distribution of lipofuscin in brain were investigated inmantis shrimp Oratosquilla oratoria by biopsy，fluorescentmicroscopy and transmission electron microscopy to research the characterization ofmorphology，distribution and ultrastructure of lipofuscin in the brain.The brain was found in the rear of ophthalmic segment and in the small sharp point of cephalothorax，and histologically the rounded cerebral nucleus with diameter of 10-30μm was distributed uniformly in the brain，especially aggregated in the protocerebral bridge cellmass.Under fluorescentmicroscopy，the lipofuscin granules with diameter of 1-3 μm were yellow-brown in color and uniformly distributed in the brain.The transmission electron microscope revealed that lipofuscin was similar to the lysosome in thatboth were covered by single-layered organellesmembrane，and in the granules filled with homogeneous electron-dense contents.The findings indicated that the lipofuscin granules in brain of the mantis shrimp had similar form to other crustaceans and uniform distribution in brain.

Key words：Oratosquilla oratoria；brain；lipofuscin；ultrastructure

中图分类号：Q954.52

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.005

文章编号：2095-1388（2016）02-0147-04

收稿日期：2015-05-18

基金项目：国家自然科学基金资助项目 （41006079）；农业部北方海水增养殖重点实验室开放课题 （2014-MSENC-KF-17）

作者简介：范青松 （1986—），男，硕士研究生。E-mail：1437937373@qq.com

通信作者：邢坤 （1984—），男，博士，副教授。E-mail：xingkun@dlou.edu.cn