刘海映，张　娜，闫红伟，刘　奇，邢　坤，陈　雷，隋宥珍，林　原，李成久，郭良勇

（1.大连海洋大学辽宁省海洋牧场工程技术研究中心，辽宁大连116023；2.大连海洋大学 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁大连116023；3.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；4.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021；5.辽宁省水产苗种管理局，辽宁大连116015）



口虾蛄卵黄蛋白原（Vg）基因的初步研究

刘海映1、2，张娜1、2，闫红伟3，刘奇1、2，邢坤1、2，陈雷1、2，隋宥珍4，林原5，李成久5，郭良勇5

（1.大连海洋大学辽宁省海洋牧场工程技术研究中心，辽宁大连116023；2.大连海洋大学 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁大连116023；3.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；4.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021；5.辽宁省水产苗种管理局，辽宁大连116015）

摘要：为研究口虾蛄Oratosquilla oratoria卵黄蛋白原 （vitellogenin，Vg）基因，利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆口虾蛄Vg基因cDNA全长序列 （GenBank登陆号：KR422400），并应用相对实时荧光定量PCR技术检测雌雄口虾蛄不同组织、不同发育时期卵巢Vg mRNA的表达量。结果表明：口虾蛄Vg基因全长7727 bp，其中5′端非编码区为36 bp，开放阅读框 （ORF）为7521 bp，3′端非编码区为170 bp，共编码2506个氨基酸；预测的氨基酸序列中存在1个长度为20个氨基酸的信号肽，1个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点 （RSKR），3个潜在的N-连接糖基化位点，1个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的KALGNVG基序；对其结构域分析表明，口虾蛄Vg蛋白含有4种保守结构域，分别为卵黄蛋白原N端结构域 （Vitellogenin_N）、血管性血友病因子 （vWFD）和两种未知功能结构域 （domain of unknown function）DUF1943与DUF1081；经NCBIBLASTP同源性比较，口虾蛄Vg氨基酸序列与其他甲壳类的相似性为46％～52％；系统发育分析结果显示，口虾蛄Vg单独聚为一支；实时定量PCR结果显示，口虾蛄Vg基因在性腺和肝胰腺中均有表达，在肌肉中均不表达，卵巢中Vg mRNA的表达量显著高于其他组织 （P＜0.05），且口虾蛄Vg mRNA的相对表达量随着卵巢的发育不断增加 （P＜0.05），在成熟期时达到最高值，随后显著下降，Vg mRNA表达量在卵巢中的变化规律可以作为了解口虾蛄性腺发育的有效指标。本研究结果为口虾蛄Vg蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：口虾蛄；卵黄蛋白原 （Vg）；分子克隆；荧光定量PCR；表达模式

卵黄蛋白原 （vitellogenin，Vg）是存在于非哺乳类卵生动物成熟雌性个体中的一种蛋白，是几乎所有卵生动物卵黄蛋白 （Vitellin，Vn）的前体。Vg在卵黄发生期迅速积累，在卵子形成、胚胎发育和幼虫阶段都发挥十分重要的作用。在卵生动物中，Vg不仅为成熟的卵母细胞发育成胚胎提供糖类、脂肪、蛋白质和其他营养物质［1］，还能作为载体结合并携带金属离子 （Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+）以及类胡萝卜素、甲状腺素、视黄醇、核黄素进入卵母细胞［2-5］。Vg虽特异地存在于卵生成熟雌性动物体内，但由于雄性及幼体动物体内也含有Vg基因 （通常不表达），当环境中含有的具雌激素效应的内分泌干扰物 （EDCs）达到一定剂量时，Vg基因也会在雄性和幼体动物中进行表达。在环境毒理学上，鱼类和水生无脊椎动物的Vg基因可以作为一种良好的生物指示物来监测环境雌激素的污染［6］。此外，关于Vg蛋白免疫学功能的研究在近些年也已成为研究热点。文昌鱼Branchiostoma lanceolatum的Vg可以抑制大肠杆菌的生长，抑制率可达90％以上［7］。埃及伊蚊Aedes aegypti的Vg可以特异性激活有效抗菌因子的大量表达，从而抵御病原体的侵入［8］。综上，Vg既是卵生动物胚胎发育的重要营养物质，也是重要的环境标志物，还跟机体免疫防御密切相关，因此，对于Vg蛋白结构、表达模式和生物学功能等方面的研究，是开展对水产动物人工繁育、病害防治和资源保护等工作的重要理论基础。

在大多数的鱼类、两栖类、昆虫、甲壳动物和少数软体动物中都开展了Vg基因的相关研究，对Vg基因的结构和生物学功能也有了比较深入的了解和认识。口虾蛄 Oratosquilla oratoria俗称虾爬子、螳螂虾等，隶属于节肢动物门Arthropoda、甲壳纲Crustacea、软甲亚纲Eumalacostraca、口足目Stomatopoda、虾蛄科Squillidae、口虾蛄属Oratosquilla，为口足类中的优势种群，是中国沿海重要的渔业品种。由于人为滥捕和海区环境被破坏等原因，口虾蛄资源量急剧减少，为了对其进行人工繁育和资源保护，开展口虾蛄生殖生理学等方面的研究显得尤为重要。目前，有关口虾蛄Vg基因的研究尚未见报道，本研究中采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术首次成功克隆了口虾蛄Vg cDNA全长序列，并对Vg基因的表达模式进行了分析，以期为其人工繁育、资源保护等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用口虾蛄采自大连近岸海域，体长为8.5～16.0 cm，雌、雄各30尾，在实验室控温循环水槽中暂养一周，水温为25℃，盐度为30，24 h充气，每天投喂新鲜菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum一次。

动物总RNA快速抽提试剂盒、去RNA酶离心管等均购自生工生物工程 （上海）股份有限公司；3′-Full RACECore Setwith PrimeScriptTMRTase试剂盒、5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒、Prime-ScriptTMⅡ High Fidelity RT-PCR试剂盒、Prime-ScriptTMRT reagent试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）、感受态大肠杆菌Escherichia coli DH5α均购自宝生物工程 （大连）有限公司（TaKaRa）；pEASY-T1 Simple Cloning试剂盒、pEASY-Blunt Simple Cloning试剂盒、Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司 （TransGen Biotech）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司 （AXYGEN Biotech）。试验用引物及DNA测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司和英潍捷基 （上海）贸易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集 将口虾蛄麻醉后于冰上解剖，取雌、雄口虾蛄的性腺、肝胰腺、肌肉组织 （各组织取自3尾口虾蛄）及4个不同发育时期 （参照Sohier等［9］的分期方法，Ⅰ为未发育期，Ⅱ为卵黄发生期，Ⅲ为成熟期，Ⅳ为消退期）的卵巢组织约50 mg（各发育阶段的卵巢组织取自3尾口虾蛄），并迅速置于液氮中，于超低温冰箱（-80℃）中保存备用。

1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 按照动物总RNA快速抽提试剂盒说明书进行总RNA提取。采用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并通过K2800核酸蛋白分析仪 （凯奥中国）检测总 RNA的纯度及其浓度，然后置于冰箱（-80℃）中保存备用。取总RNA 10μL（浓度为330 ng/μL），按照Full RACE Core Set with Prime-ScriptTMRTase试剂盒和PrimeScriptTMⅡHigh Fidelity RT-PCR试剂盒说明书分别进行反转录，反转录产物于-20℃下保存，分别用于后续Vg基因cDNA两端序列和中间序列的克隆。按照 PrimeScriptTMRT reagent试剂盒说明书进行反转录获得荧光定量PCR用cDNA。

1.2.3 口虾蛄Vg cDNA全长序列的克隆 从原有已构建的口虾蛄肝胰腺转录组测序文库中筛选出和其他卵生动物Vg基因同源的序列片段7220 bp，采用Primer 5.0软件设计 3′RACE特异性引物（Vg3-1）并合成 （表1）。根据3′-Full RACE试剂盒说明书，以雌性口虾蛄卵巢cDNA为模板扩增Vg cDNA的3′端序列。Outer PCR和Inner PCR反应条件 （Outer反应体系为25μL，Inner反应体系为50μL）：94℃下预变性3 min；94℃下变性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，Outer PCR反应共进行25个循环，Inner PCR反应共进行30个循环；最后在72℃下再延伸10 min。Inner PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收DNA后，与pEASY-T1载体连接，转化到 E.coli DH5α感受态大肠杆菌中，于37℃下孵育1 h后涂板于LB/Amp+固体培养基上，再于37℃下过夜培养，随机挑取阳性单克隆菌落于LB/Amp+液体培养基中，在37℃、160 r/min摇床上培养12 h，取3个平行菌液各5 m L，提取质粒后送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，将所得3′端cDNA序列于NCBI中用BLASTP软件进行同源性分析。

同理设计5′RACE特异性引物 （Vg5-1）并合成（表1）。根据5′-Full RACE试剂盒说明书扩增Vg cDNA的5′端序列，反应条件同上。根据已得的Vg 3′端序列和5′端序列结合口虾蛄转录组文库，利用 Primer 5.0软件设计中间序列特异性引物（GSP-F、GSP-R）并合成 （表1）。根据Prime-ScriptTMⅡHigh Fidelity RT-PCR试剂盒说明书扩增Vg cDNA的中间序列。PCR反应条件：94℃下预变性2 min；98℃下变性10 s，60℃下退火15 s，68℃下延伸7 min，共进行30个循环；最后在68℃下再延伸10 min，克隆载体为Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，其他反应条件同上。将上述所得到的测序结果结合文库序列进行人工拼接，最终得到口虾蛄Vg cDNA的全长序列。

表1　试验用引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.4 口虾蛄Vg cDNA序列的生物信息学分析在NCBI中应用ORF Finder程序寻找开放阅读框并翻译成相应的氨基酸序列，运用 ProtParam程序（http：//expasy.org/tools/protparam.html）进行蛋白质理化性质分析，利用SignalP 4.1软件进行信号肽预测，通过NCBI网站以及ScanProsite软件（http：//prosite.expasy.org/）两种方法分别预测蛋白质结构域，使用BLASTP软件对氨基酸序列进行同源性分析，用MEGA 5.0软件对甲壳动物Vg氨基酸序列采用NJ（Neighbor-Joining）法构建系统进化树。

1.2.5 口虾蛄Vg mRNA的表达分析 根据获得的口虾蛄Vg cDNA全长序列设计荧光定量检测引物Vg-F1、Vg-F2和Vg-R1、Vg-R2，以β-actin作内参基因 （表1），试验按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书进行，模板为雌、雄口虾蛄的性腺、肝胰腺、肌肉3个组织的cDNA。反应体系 （共20μL）：上、下游引物 （10 mol/L）各 1μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ （Tli RNaseH Plus）（2×）10μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，RNase-free H2O 5.6μL，模板cDNA 2μL。PCR反应采用两步法：95℃下预变性30 s；95℃下变性5 s，60℃下退火和延伸34 s，共进行40个循环。反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析以确保特异性扩增。设置3次重复，以ROX作为校正荧光，以不加cDNA模板的反应体系作为阴性对照。采取同样的方法检测不同发育时期卵巢Vg基因的表达量，条件同上。采用 ABI 7500 Real-Time PCR仪 （Applied Biosystems，美国）进行分析。

1.3 数据处理

实时荧光定量数据以2-ΔΔCT法处理，Vg mRNA相对表达量以平均值±标准差 （mean±S.D.）表示，采用 SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 口虾蛄Vg基因的结构特征

采用5′RACE和3′RACE分别获得489 bp的5′端片段以及550 bp的3′端片段，并得到中间序列6830 bp（图1、图2）。利用BioEdit软件拼接得到7727 bp Vg基因cDNA全长序列 （GenBank登录号：KR422400），经ExPASy软件分析得到包含36 bp的 5′端非编码区 （5′untranslated region，5′UTR）、7521 bp的开放阅读框 （open reading frame，ORF）、170 bp的3′端非编码区 （3′untranslated region，3′UTR）、起始密码子ATG、终止密码子TAA和转录终止信号aataaa（图3）。口虾蛄Vg的开放阅读框共编码2506个氨基酸，用Prot-Param工具分析得到Vg成熟蛋白的相对分子质量为285 770，理论等电点p I为5.42。SignalP 4.1 Prediction在线预测结果显示，口虾蛄Vg蛋白含有一个长度为20个氨基酸的信号肽 （切割位点在Gla20和Asp21之间）。口虾蛄Vg氨基酸序列中含有：1个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点R-X-R/K-R（氨基酸序列位置为 728～731，RSKR），3个潜在的N-连接糖基化位点 （氨基酸序列位置分别为660、1837和2284），1个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的KALGNVG基序 （氨基酸序列位置为484～490）。用Jpred 4在线预测口虾蛄Vg蛋白质的二级结构，得出该蛋白由α-螺旋38.71％、延伸链21.71％、β-转角8.26％、无规则卷曲31.32％组成。通过TMPRED在线软件分析表明，口虾蛄Vg为跨膜蛋白，含有两种跨膜结构，分别为膜内到膜外结构 （6～20）和膜外到膜内结构 （2441～2458）。NCBI结构域预测分析结果显示，口虾蛄Vg蛋白含有4种结构域 （图3），其中2种与已知功能结构域相似，分别为卵黄蛋白原N端结构域 （Vitellogenin_N，也被认为是脂蛋白氨基末端区域）和血管性血友病因子 （von Willebrand factor）D型结构域 （vWFD），其余2种分别为由β折叠形成的未知功能结构域 （domain of unknown function）DUF1943和与家蚕载脂蛋白 （apolipophorin）同源的未知功能结构域DUF1081。

注：A为5′RACE扩增产物电泳结果；B为3′RACE扩增产物电泳结果；C为中间片段扩增产物电泳结果。M为DL2000或DL10000 DNA Marker；1、2、3为目的产物Note：A，5′RACE amplified fragment；B，3′RACE amp lified fragment；C，Vg amplified fragment.M，DL2000 DNA Marker or DL10000 DNA Marker；1，2，3，PCR products of target fragments图1　口虾蛄Vg cDNA各部分扩增产物电泳结果Fig.1 Amplified fragments of Vg cDNA in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

图2　口虾蛄卵黄蛋白原序列的克隆策略Fig.2 Clone strategy and schematic view of Vg inmantis shrim p Oratosquilla oratoria

2.2 口虾蛄Vg氨基酸序列的同源性及系统进化分析

将推导得到的口虾蛄Vg氨基酸序列运用NCBI在线工具BLASTP软件进行同源性分析。结果表明，口足目口虾蛄Vg氨基酸序列与十足目虾蟹类的一致性为46％ ～52％，与脊尾白虾Exopalaemon carinicauda的一致性最大，为52％，与罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii、锈斑蟳 Charybdis feriata的一致性最低，均为46％（表2）。利用 MEGA 5.0软件的NJ法构建系统进化树，选择欧洲大扇贝Pecten maximus Vg氨基酸序列作为外类群。结果表明，口足目与十足目Vg聚为一大簇，其中口虾蛄Vg单独为一分支，十足目虾蟹类Vg聚为另一分支。十足目甲壳动物基本聚为四小簇：大蝼蛄虾与蟹类聚为一簇，鳌虾类为一簇，长额虾和真虾类聚为一簇，对虾类为一簇 （图4）。

2.3 口虾蛄Vg m RNA在不同组织及发育阶段的表达

采用实时荧光定量PCR对口虾蛄不同组织以及卵巢不同发育阶段的Vg mRNA表达量进行了分析。分别以3个平行样本反转录得到的混合cDNA作为模板，每个时期cDNA样品分别做3个荧光定量Vg重复和3个β-actin重复，在溶解曲线结果为单峰以及目的基因和扩增曲线图显示目的基因和内参基因的扩增效率一致的基础上，采用2-ΔΔCT法对其相对表达量 （分别以雄性虾蛄的肝胰腺和Ⅰ期卵巢的Vg mRNA表达量作为参照，将其看作单位1）进行计算。结果表明，雌、雄口虾蛄性腺和肝胰腺均有Vg mRNA表达，但肌肉中均不表达，卵巢中的Vg mRNA表达量显著高于其他组织 （P＜0.05）（图5）。此外，卵巢中Vg mRNA的相对表达量随着卵巢的发育不断增加，在成熟期的表达量是未发育期的158倍，与其他3个发育期相比差异均显著 （P＜0.05）；而产卵后，卵巢处于消退期，Vg mRNA的相对表达量急剧下降，接近卵黄发生期的表达水平 （图6）。

3 讨论

3.1 口虾蛄Vg基因的克隆及序列分析

本研究中首次克隆得到了口虾蛄Vg cDNA全长序列，也是目前唯一进行研究的甲壳动物口足目种类的Vg。克隆得到的口虾蛄Vg cDNA全长为7727 bp，共编码2506个氨基酸，预测的成熟蛋白相对分子质量为285 770，与已报到的一些其他甲壳动物的肽链长度和分子量大小相近［10-11］。

注：预测的信号肽、潜在N-糖基化位点以下划线标出；起始密码子 （ATG）、类枯草蛋白内切酶位点RSKR和终止密码子 （TAA）分别以方框标出；Vitellogenin-N结构域、未知功能结构域DUF1943与DUF1081、vWFD结构域、转录终止信号aataaa用阴影标出Note：The putative signal peptide and the potential N-linked glycocylation sites are underlined；the start codon（ATG），consensus cleavage site and stop codon（TAA）are shown in a box；Vitellogenin-N domain，domain ofunknown function DUF1943 and DUF1081，vWFD domain and polyadenylation site（aataaa）are shaded图3　口虾蛄Vg cDNA全长序列及其推导的氨基酸序列Fig.3 Full-length cDNA and deduced am ino acid sequence of Vg gene in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

图4　口虾蛄与其他甲壳动物Vg的NJ系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Vg in mantis shrimp Oratosquilla oratoria and other crustaceans

注：标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 （P＜0.05），标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 （P＞0.05），下同Note：Themeans with different letters are significant differences at the 0.05 probability level，and the means with the same letters are not significant differences，et sequentia图5　雌、雄口虾蛄不同组织中Vg mRNA的相对表达量Fig.5 Relative expression of Vg m RNA in differen t tissues of female and male mantis shrim p Oratosquilla oratoria

图6　不同发育期口虾蛄卵巢Vg m RNA的相对表达量Fig.6 Relative expression of Vg m RNA in ovary at different developmen tal stages in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

表2　口虾蛄与其他物种Vg氨基酸序列的同源性分析Tab.2 Comparative identity of Vg am ino acid sequence in mantis shrim p Oratosquilla oratoria w ith other species

生物信息学分析表明，口虾蛄Vg为跨膜蛋白，有利于其膜内外营养物质的运输，与其在卵黄发生期作为载体结合并运输金属离子、类胡萝卜素、甲状腺素、视黄醇、核黄素等生物学功能相关。口虾蛄Vg氨基酸序列与其他甲壳动物具有很高的相似性，都存在一个非常保守的R-X-K/R-R剪切位点，它是一种类似枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点，表明在此处口虾蛄卵黄蛋白能被水解成两个亚基，与Vg蛋白在机体的运输、加工和修饰有关［12］。此外，在口虾蛄 Vg蛋白的N端还发现一个在脊椎动物和无脊椎动物中都非常保守的KALGNVG序列，这段序列被认为在卵黄发生期间起着十分重要的作用，可能与卵母细胞的受体识别位点有关［13］。

对Vg蛋白结构域分析发现，口虾蛄Vg氨基酸序列含有4种保守结构域，分别为Vitellogenin_ N、vWFD和两种未知功能结构域 DUF1943与DUF1081。Vitellogenin_N参与蛋白质与脂质的转运和金属的贮存，广泛存在于卵黄蛋白原、微体甘油三酸酯转运蛋白和阿朴脂蛋白 B-100中［14］。vWFD结构域富含半胱氨酸，是一个高度结构化的区域，通过形成二硫键在寡聚体聚合过程中起到了重要作用，不仅是血液凝集因子Ⅷ结合到vWF的必需区域，也是vWF形成正常聚合所必需的［15］。Vitellogenin_N和vWFD保守结构域的存在，可确定Vg是一种脂转运蛋白，Vg蛋白一般也只包含这两种保守结构域。但是，在对贝类、甲壳动物的研究中又都发现了新的未知功能结构域［16-20］，且DUF1943和DUF1081这两个区域只存在于甲壳动物及少数贝类当中，而关于他们的准确功能尚不清楚，说明Vg蛋白还有很多未被我们认知的其他生物学功能。本研究中还发现，口虾蛄Vg氨基酸序列与大部分甲壳动物和贝类相似，都缺乏多聚丝氨酸和卵黄高磷脂蛋白结构域［21-22］。卵黄高磷脂蛋白和多聚丝氨酸结构域是指含有前后排列、串联在一起的多个丝氨酸残基的特殊结构，被认为是昆虫和大多数脊椎动物Vg蛋白的显著特征，可能是酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点，这种特殊的结构域可能参与昆虫受体介导的卵黄蛋白原进入卵母细胞的内吞过程［23-24］，而对于脊椎动物，它可能作为磷酸和金属离子的载体与骨的形成有关［25］。本试验结果表明，多聚丝氨酸和卵黄高磷脂蛋白结构域调控受体介导的方式不是口虾蛄Vg进入卵母细胞的唯一方式，即口虾蛄可能存在不同于昆虫的其他卵黄蛋白原-受体识别结合机制，今后可就卵黄蛋白原受体分离鉴定及Vg蛋白-受体结合的内在机制进行深入地研究。

由甲壳动物卵黄蛋白原氨基酸序列得到的系统进化树显示，口虾蛄Vg氨基酸序列与十足目虾蟹类的Vg为同一簇下的2个分支，十足目虾蟹类的Vg主要分为虾类和蟹类两个亚组。虾类主要分为3个亚群：枝鳃亚目对虾总科 （M.ensis、M.japonicus、P.monodon、L.vannamei、P.semisulcatus、F.chinensis、F.merguiensis）、真 虾 下 目（P.japonica、P.hypsinotus、M.rosenbergii、E.carinicauda）、鳌虾下目 （C.quadricarinatus、H.americanus）。蟹类中短尾下目 （P.trituberculatus、C.sapidus、S.paramamosain、C.feriatus、E.sinensis）和海蛄虾下目（U.major）的Vg属于一个亚组，这些物种Vg的进化关系与甲壳动物最新分类系统一致［26］。口虾蛄Vg的系统演化与口虾蛄酚氧化酶 （proPO）［27］、口虾蛄高血糖激素 （CHH）［28］在甲壳动物中的聚类分析结果一致。

3.2 口虾蛄Vg基因的表达分析

Vg的合成部位和合成机制一直是卵黄蛋白研究的重点和热点。Vg的合成途径有两种类型：内源性合成和外源性合成。鱼类、两栖类、鸟类等大多数的脊椎动物为外源性合成方式，一般由肝脏合成，然后通过血液的循环运送到卵巢，卵母细胞通过细胞内吞等方式将其吞入细胞内，然后裂解为卵黄蛋白。无脊椎动物Vg的合成比较复杂，合成部位也不一致。对于甲壳动物来说合成部位有3种：肝胰腺、脂肪体和卵巢［29-31］。本试验中分析了口虾蛄Vg mRNA在不同组织及卵巢不同发育时期的表达模式。结果表明，雌性口虾蛄卵巢和肝胰腺均有Vg mRNA表达，且卵巢中的表达量显著高于肝胰腺，表明口虾蛄的肝胰腺和卵巢都具有合成卵黄蛋白原的能力，并且主要合成部位可能在卵巢。在甲壳类中，对三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus［32］、中华绒螯蟹Eriocheirsinensis［14］、青蟹Carcinusmaena［33］、小龙虾 Cherax quadricarinatus［34］、墨吉对虾 Penaeus merguiensis［35］、刀额新对虾Metapenaeus ensis［36］、日本囊对虾Marsupenaeus japonicus［37］等种类的研究结果都与对口虾蛄的研究结果一致，均在肝胰腺和卵巢中检测到Vg基因的表达。绝大多数的研究表明，幼体和雄性中虽然也有卵黄蛋白原基因的存在，但只有雌性个体能表达该基因。有趣的是，本研究中在口虾蛄精巢中也检测到了Vg mRNA的表达，关于其原因目前尚不清楚。Unuma等［38］采用免疫组化和免疫印迹的方法检测到海胆Pseudocentrotus depressus雌、雄个体的性腺中均有Vg基因的表达，并且随着精巢的发育，其表达量逐渐减少，由此推断，卵黄蛋白原可能作为精子发育的营养物质被利用。而对真海鞘Halocynthia roretzi的研究发现［39-40］，Vg蛋白的C端所含有的结构域vWFD和CT可能定位在卵黄被 （vitellin coat）与精子中的两个酶 （HrProacrosin和HrSpermosin）结合，参与精子进入卵子的受精过程。因此，口虾蛄Vg基因在精巢中的表达可能是作为精子发生的营养物质或者参与协助精子的受精过程。口虾蛄Vg也与卵巢卵黄发育时期密切相关，卵黄蛋白原mRNA的表达量随着卵巢的发育显著增加，在消退期急剧减少。在卵巢发育过程中，卵巢需要为卵子的发生累积营养，卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，不仅能将所需的金属离子和其他营养物质运送到卵母细胞，同时卵黄蛋白原能自身水解为卵黄蛋白，在卵母细胞中累积，促使卵母细胞的生长和分化，为胚胎的发育提供碳水化合物、脂肪、氨基酸、维生素、磷、硫等营养素和功能性物质，所以在发育过程中卵黄蛋白原表达积极；进入成熟期，卵母细胞中卵黄累积达到最大；当卵巢排卵后，性腺停止发育，此时新的卵母细胞还没开始合成，卵黄蛋白原的表达量很低。口虾蛄卵巢中卵黄蛋白原mRNA相对表达量的变化趋势与对其他甲壳类的研究结果一致［41］。今后的试验可就卵黄蛋白原的合成机制进行研究，从而为口虾蛄的人工繁育和资源保护奠定理论基础。

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Vitellogenin（Vg）gene in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

LIU Hai-ying1，2，ZHANG Na1，2，YAN Hong-wei3，LIU Qi1，2，XING Kun1，2，CHEN Lei1，2，SUIYou-zhen4，LIN Yuan5，LICheng-jiu5，GUO Liang-yong5
（1.Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；4.InstituteofOcean Fisheries，Zhoushan 316021，China；5.Fisheries Seedlings Authority of Liaoning Province，Dalian 116015，China）

Abstract：In the present study，the full length cDNA of vitellogenin（Vg）gene was cloned in mantis shrimp Oratosquilla oratoria using rapid amplification of cDNA ends（RACE）（GenBank accession No.KR422400），and expression levels of Vg genemRNA in various tissues，especially in ovary within differentovarian development stages，were investigated by qPCR.The results showed that the Vg gene was 7727 bp long，with 36 bp of 5′untranslated region（UTR），170 bp of 3′UTR and 7521 bp of the coding region encoding a size of 2506 amino acids predicted protein.The predicted protein contained a signal peptide（20 amino acids long），three N-glycosylation site，a consensus cleavage site RSKR and a conserved KALGNVG motif thatwas conservative in invertebrates and vertebrate. Moreover，there were 4 conserved domains，Vitellogenin_N，vWFD，DUF1943 and DUF1081，in the predicted protein.The deduced amino acids sequence showed 46％-52％identity with other known decapods Vg by using BLASTP online analysis.Phylogenetic tree rvealed that the Vg formed a clade separated from the decapod species Vg.The qPCR indicated that the Vg mRNA were found in both gonad and hepatopancreas，and had significantly higher expression level of Vg mRNA in ovary than in other tissues（P＜0.05），withoutexpression inmuscle.In the ovary，however，the expression of Vg mRNA was found to be significantly increased from immature stage tomature stage（P＜0.05），then dropped immediately（P＜0.05）.The expression profile in ovary wellwas responding to the annual cycle of vitellogenesis.The findingswill provide basic information for understanding of thewhole function of Vg gene in themantis shrimp.

Key words：Oratosquilla oratoria；vitellogenin（Vg）；molecular cloning；quantitative PCR；expression pattern

中图分类号：S917.4；S966.1

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.003

文章编号：2095-1388（2016）02-0131-09

收稿日期：2015-05-06

基金项目：辽宁省教育厅一般项目 （L2015083）；辽宁省科学技术计划项目 （2014203016）；农业部北方海水增养殖重点实验室开放课题（2014-MSENC-KF-14）；大连海洋大学博士启动基金资助项目 （2014017349）

作者简介：刘海映 （1957—），男，教授。E-mail：hyliu@dlou.edu.cn

通信作者：闫红伟 （1985—），女，博士。E-mail：yanhongwei@dlou.edu.cn