李磊，李海畅，高婧，周贻兵（.贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所，贵州贵阳550004；.贵阳市疾病预防控制中心，贵州贵阳55000）



QuEChERS EMR- Lipid- LC/MS/MS测定8种β-受体激动剂

李磊1，李海畅2，高婧1，周贻兵1
（1.贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所，贵州贵阳550004；2.贵阳市疾病预防控制中心，贵州贵阳550002）

摘要：建立以QuEChERS EMR-Lipid为前处理测定动物源性食品中8种β-受体激动剂的LC-MS/MS方法。样品经粉碎混匀后加入pH为5.2乙酸-乙酸铵溶液，以β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解液经QuEChERS EMR-Lipid净化后，取乙腈层与0.1%的甲酸水溶液混合上LC-MS/MS进行分析。8种β-受体激动剂在测定浓度范围内线性关系良好，各组分相关系数R2＞0.998，加标回收率范围79.1%～94.8%，方法精密度范围5.4%～9.4%，测定各组分β-受体激动剂检出限范围0.2μg/kg～0.4μg/kg，定量限范围0.5μg/kg～1.0μg/kg。

关键词：β-受体激动剂；高效液相色谱串联质谱；QuEChERS；脂质去除；肉制品

β-受体激动剂又名瘦肉精，是一类人工合成药物，具有营养在分配作用，可明显提高瘦肉率，上世纪中期曾被广泛添加于畜禽类饲料中［1-2］。人体摄入含有β-受体激动剂的动物组织将会出现肌肉震颤、心悸、恶心、眩晕和紧张等症状［3］。我国在2002年将β-受体激动剂列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》［4］。然而在经济利益的驱使下，依然存在β-受体激动剂滥用的问题。

目前对于肉制品中β-受体激动剂的检测方法主要有气相色谱-质谱法［5-6］、液相色谱法［7］和液相色谱-串联质谱法［8-9］。气相色谱-质谱法由于需要进行衍生后测定，操作过程复杂，不适用于多种目标物同时分析。液相色谱法使用保留时间进行定性，由于肉制品基质复杂，容易受到基质干扰出现假阳性结果。液相色谱-串联质谱法特异性强、灵敏度高，是现阶段测定β-受体激动剂的首选方法，但是由于其前处理过程主要依赖于固相萃取法进行净化，操作过程复杂，分析成本高昂。本文在已有研究基础上，使用增强型脂质快速净化（QuEChERS EMR-Lipid）前处理方法对肉制品进行净化后测定8种β-受体激动剂，极大简化了前处理方法，降低了分析成本，为β-受体激动剂的检测提供了新的思路。

1　材料与方法

1.1主要仪器

TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪、戴安U3000超高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish EMR-Lipid：安捷伦科技有限公司；3-30KS离心机：德国Sigma公司；SB25-12YDTD超声水浴锅：宁波新芝生物科技公司；UP1600超纯水机：艾普科技公司。

1.2标准品及试剂

标准品非诺特罗、福莫特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、异丙喘宁（纯度≥95.5%）：购自Dr.Ehrenstorfer公司；β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶：购自德国sigma公司；甲醇、甲酸（HPLC纯）：购自美国Fisher公司；乙腈（HPLC纯）：购自德国Merck公司；乙酸铵、乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.3样品前处理

称取粉碎混匀后的样品2.0 g，于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH 5.2）10 mL，加入β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶20 μL，漩涡混匀后于37℃下过夜酶解。将酶解后样品漩涡混匀，4℃下10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液于增强型脂质快速净化管中（QuEChERS dSPE EMRLipid）并加入5 mL乙腈漩涡混匀2 min，静置1 min后于7 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液加入脂质净化反萃取管中（QuEChERS Final Polish EMR-Lipid），漩涡混匀1 min后于5 000 r/min离心5 min。取上层乙腈0.5 mL与0.1%甲酸水0.5 mL混合后过0.45 μm滤膜，LC-MS/MS检测。

1.4超高效液相色谱及质谱条件

1.4.1超高效液相色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil Gold（200 mm×2.1 mm，1.9 μm）（Thermo Fisher公司）；进样量10 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃。梯度进样程序见表1。

表1　梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+模式）；多反应监测MRM模式；喷雾电压正离子模式3 000 V；离子源温度320℃；脱溶剂温度270℃；鞘气（N2）40 arb；辅助气（N2）8 arb。质谱条件参数见表2。

表2　质谱参数Table 2 Mass condition

2　结果与讨论

2.1 QuEChERS EMR-Lipid与固相萃取小柱净化效果对比

由于肉制品基质成分复杂，测定动物源性食品β-受体激动剂前必须经过除脂净化后才能进行质谱分析，而目前净化方法主要依赖于固相萃取法来完成［8-9］。固相萃取法作为前处理的经典方法，虽然有广泛的应用基础，但是操作过程繁琐，材料和时间成本都相对较高，且在上样及淋洗过程中容易产生吸附不完全而导致穿透使分析目标物损失。QuEChERS EMR-Lipid方法作为QuEChERS的改良方法，不仅具有QuECh－ERS快速、易操作的特点，对于质谱分析还具有高效的净化能力。在实际应用中对比两种前处理方法的加标回收率测定结果见表3。

表3　不同前处理方法加标回收率结果（n = 6）Table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

续表3　不同前处理方法加标回收率结果（n = 6）Continue table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

2.2酶解提取条件与QuEChERS净化条件的选择

QuEChERS EMR-Lipid法在测定动物源性食品中多残留时，使用乙腈进行直接提取［10］，但β-受体激动剂在动物体内多以结合态形式存在，在提取前应进行酶解使得结合态的β-受体激动剂变为游离态才能获得较高提取效率。笔者利用0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH 5.2）中的β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶破坏苯酚类、间苯二酚类β-受体激动剂苯环上的羟基结合位点，使β-受体激动剂由结合态转化为游离形态后，改良了QuEChERS EMR-Lipid操作，使得提取效率极大提高。

2.3色谱条件优化

样品经过EMR-Lipid Polish反萃后，直接使用乙腈层上机分析发现峰形出现分叉现象，考虑到方法灵敏度及峰形的尖锐、对称，笔者将0.5 mL反萃后的乙腈与0.5 mL的0.1%甲酸水进行混合后上机测定，最终样品测定峰形见图1、图2。

2.4质谱条件优化

质谱优化采用微量进样泵连续进样方式进行，将8种β-受体激动剂的标准溶液（10 ng/mL）进行一级质谱扫描，确定各个组分准分子离子，优化喷雾电压、离子源温度、脱溶剂温度、鞘气、辅助气条件，使8种β-受体激动剂母离子综合响应强度达到最佳。将获得的母离子进行二级质谱扫描，分别优化8种β-受体激动剂的碎片离子，对碰撞能量、透镜电压进行优化，选择丰度较高的两个碎片离子作为定性和定量离子。

图2　样品中莱克多巴胺、克伦特罗、福莫特罗、妥布特罗选择反应监测（MRM）扫描图谱Fig.2 Rackdopamine，clenbuterol，formoterol，tulobuterol of samples MRM scan results

2.5方法线性及检出限

将空白基质样品，按照方法1.3进行处理，取乙腈层0.5 mL，另取8种β-受体激动剂的混合标准溶液0.5 mL混匀后配置成基质匹配的标准曲线，以响应强度的峰面积为纵坐标，以质量浓度（μg/L）作为横坐标，绘制标准系列曲线，线性方程见表3。将线性范围最低浓度点稀释并上机测定，以3倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为检出限，以10倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为定量限，结果见表3。

表3　8种β-受体激动剂线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 8 β-agonists

2.6方法回收率及精密度

选择猪肉、猪肝样品以低、中、高3个浓度进行加标回收试验，低、中、高组加标回收试验分别添加10、50、100 μg/kg质量浓度的混合标准物质，按照1.3所述样品前处理方法进行处理后测定加标回收率，平行测定6组，考察方法精密度，结果见表4。试验结果显示各种β-受体激动剂的回收率范围为79.1%～94.8%，精密度范围为5.4%～9.4%。

3　结论

本文建立了以QuEChERS EMR-Lipid为前处理方法，并运用超高效液相色谱串联质谱测定肉制品中8种β-受体激动剂的方法。该方法相对于固相萃取前处理方法，具有操作简单，有较高的基质干扰消除能力，方法准确度、灵敏度高，能够满足肉制品中β-受体激动剂的检测要求。

表4　8种β-受体激动剂加标回收率及精密度（n = 6）Table 4 Recoveries and RSD of 8 β-agonists（n = 6）

参考文献：

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［4］中华人民共和国农业部.食品动物禁用的兽药及其它化合物清单（农业部第193号公告）［Z］. 2002

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Determination of 8 β-Agonists by QuEChERS EMR-Lipid-LC/MS/MS

LI Lei1，LI Hai-chang2，GAO Jing1，ZHOU Yi-bing1

（1. Clinical Laboratory，Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2. Guiyang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Key words：β-agonists；LC-MS/MS；QuEChERS；EMR-Lipid；meat

Abstract：A method with QuEChERS EMR-Lipid pretreatment for the determination of 8 β-agonists in animal tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was established. The crushed sample was added to sodium acetate（pH 5.2）and enzymatic hydrolysis by β-Glucuronidase/Arysulfatase. The sample was purified by QuEChERS EMR-Lipid and took the acetonitrile mixed with 0.1%formic acid solution，then detected by LC-MS/MS. The 8 kinds of β-agonists showed good linear relationship between the concentration range，components correlation coefficient R2＞0.998，standard addition recovery range between 79.1%-94.8%，precision range 5.4%-9.4%，LOD components range 0.2 μg/kg-0.4 μg/kg and LOQ components range 0.5 μg/kg-1.0 μg/kg.

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.042

作者简介：李磊（1986—），男（汉），主管技师，硕士研究生，从事环境及食品卫生检验。

收稿日期：2016-02-22