程宝仓，白宏英，郑世茹，杨会杰

450014 河南省郑州市，郑州大学第二附属医院神经内科



·论著 ·

姜黄素对鱼藤酮诱导的黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用

程宝仓，白宏英，郑世茹，杨会杰

450014 河南省郑州市，郑州大学第二附属医院神经内科

【摘要】目的观察姜黄素对由鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠模型黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用并探讨其可能机制。方法2014年12月—2015年5月，选取清洁级雄性SD大鼠80只按随机区组法分为溶剂对照组、姜黄素组、鱼藤酮组、治疗组，每组20只。采用脑切片免疫组化染色法检测大鼠脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数，Western blotting法检测大鼠脑黑质区沉默信息调节因子3(SIRT3)、P47phox表达水平，流式细胞仪检测大鼠脑黑质区活性氧(ROS)水平。结果4组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组(P<0.05)；治疗组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组(P<0.05)。4组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组(P<0.05)；治疗组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组(P<0.05)。鱼藤酮组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组(P<0.05)；治疗组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组(P<0.05)。4组大鼠脑黑质区ROS水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组(P<0.05)；治疗组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组(P<0.05)。结论姜黄素可有效拮抗鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤，其机制可能与姜黄素通过促进SIRT3的表达清除小胶质细胞源性ROS有关。

【关键词】帕金森病；鱼藤酮；姜黄素；多巴胺能神经元；沉默信息调节因子3；P47phox；大鼠

程宝仓，白宏英，郑世茹，等.姜黄素对鱼藤酮诱导的黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用[J].中国全科医学，2016，19(12)：1462-1466.[www.chinagp.net]

Cheng BC,Bai HY,Zheng SR，et al.Protective effect of curcumin on rotenone-induced dopaminergic neuron injury in the substantia nigra[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1462-1466.

帕金森病(Parkinson disease，PD)是神经系统第二大变性病,以黑质多巴胺(DA)能神经元进行性变性死亡为主要病理特征。近年来，在动物模型和PD患者脑中除了发现大量DA能神经元缺失外，还发现了大量增生的胶质细胞[1]。炎性反应在脑中的标志是小胶质细胞的激活，因此神经炎性反应在 PD 发病中的作用受到广泛关注[2]，抑制小胶质细胞过度激活可能代表了在 PD 中减少DA能神经元进行性变性死亡的一个治疗方向。姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面药理作用，还能够调节和抑制小胶质细胞的表达和迁移[3]。研究显示，姜黄素能够通过促进转录因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)的表达减少细胞内活性氧(ROS)的产生，从而延缓细胞的衰老或凋亡[4]。沉默信息调节因子3(SIRT3)在对抗氧化应激中起重要作用，但是姜黄素能否通过SIRT3减少小胶质细胞源性ROS保护PD能神经元目前仍缺乏相关研究。为此，本研究选择姜黄素治疗鱼藤酮诱导的慢性PD SD大鼠模型，拟观察姜黄素对DA能神经元的保护作用及SIRT3所介导的具体机制。

1材料与方法

1.1实验动物2014年12月—2015年5月，选取清洁级健康雄性SD大鼠80只，体质量200～220 g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(晋)20150001。室温(25±2) ℃饲养，自然光照。

1.2主要试剂一抗分别为兔抗大鼠酪氨酸羟化酶(TH)多克隆抗体(1∶200，美国 Santa cruz 公司)、兔抗大鼠SIRT3多克隆抗体(1∶1 000，美国 Santa cruz 公司)、兔抗大鼠P47phox多克隆抗体(1∶1 000，美国 Santa cruz 公司)；二抗为生物素化羊抗兔、抗鼠IgG(1∶4 000，美国 Santa cruz 公司)；ROS检测试剂盒购自中国碧云天公司；姜黄素、葵花油均购自美国 Sigma 公司；二甲基亚砜购自阿拉丁科技(中国)有限公司。

1.3方法

1.3.1分组及PD模型建立所有大鼠经3次行为测试确认无自发行为异常并适应性饲养5 d后，按随机区组法分为溶剂对照组、姜黄素组、鱼藤酮组、治疗组(鱼藤酮+姜黄素)，每组20只。鱼藤酮组与治疗组大鼠采用颈背部皮下注射1.5 mg/ml鱼藤酮葵花油乳化液1.5 mg·kg-1·d-1，连续注射28 d[5]。溶剂对照组及姜黄素组方法同上，但只注射不含鱼藤酮的等量葵花油。

本研究创新点：

姜黄素具有抗氧化、抗感染、抗癌、清除自由基等多方面药理作用，还能够调节和抑制小胶质细胞的表达和迁移，延缓细胞的衰老或凋亡。沉默信息调节因子3(SIRT3)在对抗氧化应激中起重要作用，但是姜黄素能否通过SIRT3减少小胶质细胞源性活性氧类物质(ROS)保护黑质多巴胺能细胞目前仍缺乏相关研究。为此，本研究选择姜黄素治疗鱼藤酮诱导的慢性帕金森病SD大鼠模型，探讨姜黄素对黑质多巴胺能神经元的保护作用及SIRT3所介导的具体机制。

1.3.2神经功能评分在造模28 d后的同一时间点，观察大鼠有无毛色变黄粗糙、活动迟缓、弓背竖毛、拒捕行为减弱、不自主运动等异常形态及行为，并评分。评分标准按照陈忻等[5]建立的大鼠行为变化评分体系进行。行为学评分2分以上为造模成功，最后每组均以TH免疫组化法作组织学鉴定。

1.3.3姜黄素灌胃治疗姜黄素组及治疗组在造模成功24 h后予以4 mg/ml姜黄素二甲基亚砜溶液40 mg·kg-1·d-1灌胃治疗，连续治疗28 d。溶剂对照组与鱼藤酮组同步每日灌胃二甲基亚砜10 ml·kg-1·d-1，连续治疗28 d。28 d后将大鼠全部处死。

1.3.4免疫组化染色检测TH阳性细胞数每组随机取10只大鼠经心脏灌注4%多聚甲醛溶液固定，取脑，石蜡包埋切片，常规脱蜡、水化、抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗，加入封闭血清、一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗，加二抗、链霉卵白液，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，中性树胶封固,光镜下观察，TH阳性细胞呈棕灰色。阴性对照：以正常兔血清代替一抗，其余步骤同上。正常脑组织与鱼藤酮损伤后脑组织比较再次验证了造模成功。

1.3.5Western blotting法检测SIRT3、P47phox表达水平每组其余10只大鼠新鲜取脑，-80 ℃保存。将脑组织定位取出黑质后，把黑质部分剪切成小块，取一半(另一半用于测定ROS水平)放于预冷的玻璃匀浆器中，加入蛋白裂解液，超声粉碎，4 ℃裂解过夜，裂解液于4 ℃、12 000×g离心10 min，吸取上清液于4 ℃保存。蛋白质定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford法)。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，分别加入SIRT3、P47phox抗体，脱脂奶粉孵育过夜，加二抗，曝光，进行图像分析。

1.3.6流式细胞仪检测ROS水平取另一半黑质，PBS冲洗，300目尼龙网过滤，以1 000×g离心5 min后加入无血清DMEM细胞培养基制成浓度为1×106/ml单细胞悬液；向单细胞悬液中加入终浓度为10 μmol/L 的2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，37 ℃孵育20 min后用DMEM细胞培养基洗涤细胞3次。流式细胞仪(激发波长488 nm，发射波长525 nm)检测荧光强度，以平均荧光强度表示ROS水平。

2结果

2.14组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较4组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组，差异有统计学意义(P<0.05)；溶剂对照组与姜黄素组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1、图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

Table1ComparisonofthenumberofTHpositivecellsinthesubstantianigraamongthefourgroups

组别只数TH阳性细胞数溶剂对照组10389±54 姜黄素组10405±27 鱼藤酮组10 50±7ab 治疗组10119±11abcF值347.149P值<0.001

注：与溶剂对照组比较，aP<0.05；与姜黄素组比较，bP<0.05；与鱼藤酮组比较，cP<0.05；TH=酪氨酸羟化酶

2.24组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较4组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。溶剂对照组与姜黄素组脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2、图2)。

Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofSIRT3andP47phoxinthesubstantianigraamongthefourgroups

组别只数SIRT3P47phox溶剂对照组100.54±0.050.09±0.01姜黄素组100.55±0.050.08±0.01鱼藤酮组100.08±0.01ab0.65±0.05ab治疗组100.24±0.02abc0.32±0.03abcF值371.010736.405P值<0.001<0.001

注：与溶剂对照组比较，aP<0.05；与姜黄素组比较，bP<0.05；与鱼藤酮组比较，cP<0.05；SIRT3=沉默信息调节因子3

注：1为溶剂对照组 ，2为姜黄素组，3为鱼藤酮组，4为治疗组；SIRT3=沉默信息调节因子3

图2Western blotting法检测4组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox的表达

Figure 2Expression of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra of the four groups detected by Western blotting method

注：箭头所指为TH阳性细胞

图1光镜下观察4组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数(免疫组化染色，×400)

Figure 1Number of TH positive cells in the substantia nigra of the four groups observed under light microscope

2.34组大鼠脑黑质区ROS水平比较4组大鼠脑黑质区ROS水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组比较，低于鱼藤酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。溶剂对照组与姜黄素组大鼠脑黑质区ROS水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

Table3ComparisonofthelevelofROSinthesubstantianigraamongthefourgroups

组别只数ROS溶剂对照组10 42±4 姜黄素组10 40±4 鱼藤酮组10239±19ab治疗组10116±22abcF值395.099P值<0.001

注：与溶剂对照组比较，aP<0.05；与姜黄素组比较，bP<0.05；与鱼藤酮组比较，cP<0.05；ROS=活性氧

3讨论

研究表明，小胶质细胞介导的氧化应激损伤在PD的发病过程中起到了重要的作用[6]。小胶质细胞是自由基的一个重要来源，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶是小胶质细胞的一种重要的调质，是小胶质细胞源性ROS的原始来源和小胶质细胞内促发炎症信息的一个机制。NADPH氧化酶是由p47phox、p67phox、p40phox、p22phox、gp91phox和Rac 6个亚基组成的酶复合体，其中p47phox是NADPH氧化酶的关键亚基，p47phox在小胶质细胞源性ROS的形成中发挥着重要作用。

Sirtuins家族是一组依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙酰化酶，在哺乳类中表达SIRT1～7 7种亚型，广泛分布于各种组织，参与调控细胞的老化、凋亡和能量代谢等[7]。SIRT3是唯一与人类老化相关的Sirtuins家族成员，作为细胞内多个通路的关键调控因子，SIRT3开始成为PD等老年神经退行性疾病研究的新方向[8]。SIRT3 可通过去乙酰化作用于相关底物，激活一系列反应还原ROS，保护细胞免受氧化损伤，其对氧化应激的保护作用，较Sirtuins家族其他成员更为突出。在神经系统的基础研究中，Someya等[9]发现，SIRT3可去乙酰化线粒体异枸橼酸脱氢酶2(IDH2) 酶而减少线粒体内ROS，上调其表达可减缓老化相关性耳聋的发病。而Kim等[10]更进一步证实SIRT3 在神经元中亦表达，可通过降低细胞内ROS，减缓NMDA引起的神经兴奋性损伤。以上证据均表明SIRT3减少细胞内ROS起神经保护作用，因此本研究推测SIRT3可能通过抑制p47phox的表达来减少小胶质细胞源性ROS的产生从而参与了PD的神经保护。

本研究结果显示，鱼藤酮组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组，ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组，说明环境毒素鱼藤酮能够使SD大鼠脑黑质区TH阳性细胞数显著减少，同时使细胞内ROS水平明显升蒿，从而损伤DA能神经元。因为鱼藤酮能够抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性，选择性地阻断Fe-S簇与辅酶Q的作用,使ROS的生成增加。推测姜黄素可能通过使SIRT3表达增加从而抑制p47phox的表达来清除小胶质细胞内的ROS从而保护DA能神经元。于是，本研究测定大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox的表达水平以及小胶质细胞内的ROS水平，结果显示鱼藤酮组大鼠脑黑质区SIRT3表达水平明显减少，P47phox表达水平、ROS水平明显升高；经姜黄素干预治疗后，治疗组脑黑质区TH阳性细胞数、SIRT3表达水平较鱼藤酮组明显升高，P47phox表达水平、ROS水平较鱼藤酮组明显降低。因此，笔者推测姜黄素通过促进SIRT3的表达从而抑制p47phox的表达来清除鱼藤酮诱导的小胶质细胞源性ROS水平，进而保护受损的DA能神经元；并且鱼藤酮能够抑制小胶质细胞线粒体复合物Ⅰ对氧的利用，产生大量ROS，而小胶质细胞源性ROS水平的升高又可促使小胶质细胞的过度激活造成DA能神经元的损伤。提示姜黄素通过清除小胶质细胞源性ROS，抑制小胶质细胞的过度激活，从而保护DA能神经元。

综上所述,本研究提示在鱼藤酮诱导的PD大鼠模型中，TH阳性细胞数、SIRT3表达水平减少，P47phox表达水平、ROS水平升高，姜黄素通过促进SIRT3的表达清除小胶质细胞源性ROS从而保护DA能神经元，为进一步的临床研究提供了参考依据。

作者贡献：程宝仓进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；郑世茹、杨会杰进行实验实施、评估、资料收集；白宏英进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

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[3]Karlstetter M,Lippe E,Walczak Y,et al.Curcumin is a potent modulator of microglial gene expression and migration[J].J Neuroinflammation，2011,29(8):125.

[4]Li W,Wu M,Tang L,et al.Novel curcumin analogue 14p protects against myocardial ischemia reperfusion injury through Nrf2-activating anti-oxidative activity[J].Toxicol Appl Pharmacol,2015,282(2):175-183.

[5]陈忻,张楠,赵晖，等.鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(4):232-234.

[6]Tansey MG,Goldberg MS.Neuroinflammation in Parkinson′s disease:its role in neuronal death and implications for therapeutic intervention[J].Neurobiol Dis,2010,37(3):510-518.

[7]Schwer B,Bunkenborg J,Verdin RO,et al.Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(27):10224-10229.

[8]Huber K,Superti-Furga G.After the grape rush:sirtuins as epigenetic drug targets in neurodegenerative disorders[J].Bioorg Med Chem,2011,19(12):3616-3624.

[9]Someya S,Yu W,Hallows WC,et al.SIRT3 mediates reduction of oxidative damage and prevention of age-related hearing loss under caloric restriction[J].Cell,2010,143(5):802-812.

[10]Kim SH,Lu HF,Alano CC.Neuronal SIRT3 protects against excitotoxic injury in mouse cortical neuron culture[J].PLoS One,2011,6(3):e14731.

(本文编辑：李婷婷)

Protective Effect of Curcumin on Rotenone-induced Dopaminergic Neuron Injury in the Substantia Nigra

CHENGBao-cang，BAIHong-ying，ZHENGShi-ru，etal.DepartmentofNeurology，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of curcumin on rotenone-induced dopaminergic neuron injury in the substantia nigra of model rats with chronic Parkinson disease (PD) and it possible mechanism.MethodsFrom December 2014 to May 2015,80 cleaned male SD rats were selected and randomly divided into solvent control group,curcumin group,rotenone group and treatment group,20 rats in each group.Brain section immuno-histochemical staining method was used to detect the number of positive cells of tyrosine hydroxylase(TH) in the substantia nigra.The expression levels of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra were detected using Western blotting method,and reactive oxygen species (ROS) in the substantia nigra was detected using flow cytometry.ResultsThe four groups were significantly different in the number of TH positive cells in the substantia nigra (P<0.05).Rotenone group was lower than solvent control group and curcumin group in the number of TH positive cells in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was lower than solvent control group and curcumin group and was higher than rotenone group in the number of TH positive cells in the substantia nigra(P<0.05).The four groups were significantly different in the expression levels of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was lower than solvent control group and curcumin group in the expression level of SIRT3 in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was lower than solvent control group and curcumin group and higher than rotenone group in the expression level of SIRT3 in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was higher than solvent control group and curcumin group in the expression level of P47phox in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was higher than solvent control group and curcumin group and lower than rotenone group in the expression level of P47phox in the substantia nigra(P<0.05).The four groups were significantly different in ROS level in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was higher than control group and curcumin group in ROS level in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was higher than solvent control group and curcumin group and lower than rotenone group in ROS level in the substantia nigra(P<0.05).ConclusionCurcumin can effectively antagonize rotenone-induced dopaminergic neuron injury in rats with chronic PD,and the mechanism may be related with the obliteration of microglia-derived ROS by increasing the expression of SITR3.

【Key words】Parkinson disease；Rotenone；Curcumin；Dopaminergic neurons；SIRT3；P47phox；Rats

(收稿日期：2015-10-29；修回日期：2016-01-26)

【中图分类号】R 742.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.021

通信作者：白宏英，450014 河南省郑州市，郑州大学第二附属医院神经内科；E-mail:hybai@126.com

基金项目：2014年河南省科学技术厅基础与前沿技术研究计划项目(142300410461)

·中医·中西医结合研究·