克晓燕

100191北京市，北京大学第三医院血液科



·新进展·

嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的应用进展

克晓燕

100191北京市，北京大学第三医院血液科

【摘要】嵌合抗原受体(CAR)将单链抗体可变区与T细胞的活化基序相融合，使其修饰的T细胞具有非主要组织相容性复合物(MHC)限制性识别肿瘤抗原及杀伤靶细胞的双重功能。CAR细胞内区的结构从表达单一信号分子的第1代，发展为添加1个及2个以上共刺激分子的第2代和第3代以及增加了编码CAR和/或其启动子、自杀基因等的第4代，使T细胞在体内的存活时间和杀伤能力明显增强且能够调控。本文就CAR-T细胞免疫治疗的原理、在血液系统恶性肿瘤中的应用以及主要不良反应和应对措施进行分析，发现应用CAR-T细胞免疫治疗多种血液系统恶性肿瘤取得了较好临床疗效，其中以靶向CD(19)的CAR-T细胞免疫治疗疗效尤为突出，患者的生存期延长、生活质量改善并且不良反应较少。CAR-T细胞免疫治疗的主要不良反应是脱靶效应和细胞因子释放综合征，需要引起临床足够重视。

【关键词】血液肿瘤；嵌合抗原受体；T细胞；免疫治疗

克晓燕.嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的应用进展[J].中国全科医学，2016，19(12)：1361-1366.[www.chinagp.net]

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传统的放疗、化疗、手术、造血干细胞移植等治疗方法延长了部分血液系统恶性肿瘤患者的生存时间，但是复发、难治甚至耐药现象，仍是目前面临的巨大挑战。近年来，细胞免疫治疗因在肿瘤的治疗中取得了突破性进展，成为血液系统等多种肿瘤治疗的重要手段，被Science杂志列为2013年十大科学突破的首位[1]。其中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞免疫治疗进展尤为突出，自Gross等[2]1989年首次提出这一概念至今，CAR-T细胞在治疗包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤等的多项临床研究中表现出了良好的靶向性、杀伤活性和持久性，成为治疗血液系统恶性肿瘤的有效方法。本文将主要介绍CAR-T细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的原理、临床应用、主要不良反应及应对措施等。

1CAR-T细胞免疫治疗原理

1.1CAR-T细胞作用原理T细胞的活化有赖于双信号系统共同作用：第一信号由T细胞表面受体(TCR)与Ⅰ类、Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)结合；第二信号主要由抗原递呈细胞上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28相结合产生协同刺激信号(即B7/CD28协同刺激信号)[3]。CAR-T细胞免疫治疗是利用基因工程的方法，将识别目标抗原的单链抗体与间隔区、跨膜基序和T细胞的活化基序等结合为一体，利用该融合基因修饰T细胞，既能够特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备T细胞自我更新和杀伤能力，可不受肿瘤局部微环境免疫抑制、以非MHC限制性的方式特异性杀伤肿瘤细胞[4]。

1.2CAR的结构CAR的模块化结构主要包括：细胞外抗原结合区、铰链区、中间的跨膜区域和细胞内信号转导区(见图1)[5]。细胞外区为单克隆抗体的单链可变区(single chain variable fragment,scFv)，由轻链和重链共同组成，能够识别特定肿瘤抗原；跨膜区有H2-Kb、FcεRIc、CD4、CD7、CD8、CD28和CD3ζ等[6]，将CAR结构锚定于T细胞膜上；细胞内区为T 细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白 Fc 受体 FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs)，可发挥信号转导功能[4]。目前，已有多种肿瘤抗原可用作细胞外区识别，包括CD19、CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)/neu、GD2、ROR1和碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)等[7]。不同的跨膜区表达CAR的能力不同，Pulè等[8]发现，含有CD28的跨膜区表达CAR的能力最强，含有CD134(OX40)的跨膜区次之，而含有CD3ζ的跨膜区表达能力最低。

图1　CAR的结构

根据细胞内的区结构不同，CAR可划分为4代：第1代CAR(scFv+信号转导区)，细胞内区只表达单一的信号分子(TCR/CD3ζ链或FcεRIγ链)，不表达共刺激分子，能够识别靶抗原并激活T细胞，但不转导增殖信号和诱导细胞因子产生，体内无法持续抗肿瘤；第2代CAR(scFv+信号转导区+一种共刺激分子)，细胞内区添加了一个共刺激分子〔如CD27、CD28、OX40、可诱导共刺激分子(inducible costimulatory molecule,ICOS)或CD137(4-1BB)等〕，可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力[9]；第3代CAR(scFv+信号转导区+二种以上共刺激分子)，细胞内区整合了2个以上的协同刺激分子，与第2代CAR相比，T细胞活化、增殖、分泌细胞因子及细胞毒素作用更强，但靶向识别特异性降低，低亲和分子亦可促进T细胞活化，可产生细胞因子风暴[10- 11]；第4代CAR(又称TRUCKs)，在第3代CAR的基础上增加了编码CAR和/或其反应性启动子的载体，在转基因产生的细胞因子作用下CAR产生有效信号，并能够招募免疫系统其他成员，放大抗肿瘤免疫效应[12-13]。最近一项研究在动物体内应用双特异性CAR-T细胞，发现其具有招募抗体以及抗肿瘤的活性[14]。也有研究在CAR结构中引入自杀基因，以调控T细胞的杀伤能力和扩增能力[15]；还可构建对多种肿瘤均有很强亲和力的通用CAR(universal CAR,uCAR)，通过使T细胞迅速扩增、产生大量细胞因子，增强其抗肿瘤作用[16-17]。

本文背景和要点：

近年来，随着分子生物学、免疫学等基础学科的进展，细胞免疫治疗成为包括血液恶性肿瘤在内的多种恶性肿瘤治疗的重要手段，被Science杂志列为2013年十大科学突破之首。其中，关于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的临床研究首先在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了令人振奋的效果，靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗能够将急性淋巴细胞白血病患者的完全缓解率提高至90%，成为目前研究的热点。另一方面，CAR-T细胞免疫治疗还处于发展阶段，在淋巴瘤、骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤及实体瘤的治疗中还有很大的发展空间。本文对CAR-T细胞免疫治疗的原理、应用于血液系统恶性肿瘤的临床试验以及该疗法主要的不良反应和应对措施进行评价及分析，旨在为CAR-T细胞免疫治疗更规范、有效的应用于血液系统肿瘤提供思路和方向。

2CAR-T细胞免疫治疗的临床应用

目前，应用CAR-T细胞免疫治疗血液系统恶性肿瘤，主要包括构建靶向CD19、CD20、Kappa轻链、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD70等抗体的CAR来修饰T细胞进行临床试验，其中以靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗的疗效尤为突出[5,18]。

2.1CAR-T细胞免疫治疗在白血病中的应用CD19特异性表达于恶性B细胞和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不表达CD19，因此目前靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗在临床上研究最多[19]。早期应用第1代靶向CD19的CAR-T细胞，因缺乏共刺激分子、T细胞体内存活时间较短、释放细胞因子有限，治疗效果并不显著[20]。后续临床试验多选用第2代CAR-T细胞，抗肿瘤作用明显提升，如Maude等[21]应用自体抗CD19的第2代CAR-T细胞(CTL019)免疫治疗30例复发/难治急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患儿，其中90%(27例)达完全缓解(CR)，持续缓解6个月的无事件生存率为67%，即使干细胞移植失败的患者亦可持续缓解达24个月；Davila等[22]应用自体抗CD19的第2代19-28z CAR-T细胞免疫治疗16例复发ALL的成人患者，CR率亦达到88%；Lee等[23]应用自体抗CD19的第2代CAR-T细胞免疫治疗20例复发/难治的儿童和成人ALL患者，CR率可达70%，61%的患者脑脊液中可检测到CAR-T细胞，且输注1×106个/kg CAR-T细胞未出现明显不良反应。

一些临床前研究发现，CAR-T细胞免疫治疗可能具有根治急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)的潜力，但多数AML细胞与造血干细胞或早期祖细胞公用抗原，故限制了其应用[24]。最早被选作CAR-T细胞免疫治疗AML的靶点是Lewis Y寡糖抗原(LeY)，应用LeY-CAR-T细胞免疫治疗AML移植瘤NOD/SCID鼠，可明显减缓肿瘤生长[25]。之后一项Ⅰ期临床试验应用靶向LeY抗原的自体第2代CAR-T细胞免疫治疗4例复发的AML患者，其中1例达细胞学缓解，其余3例获得了部分缓解(PR)/病情稳定(SD)，且未见明显不良反应[26]。应用抗CD123的第2代CAR-T细胞(CD123scFv-CD127-CD3ζ)免疫治疗AML免疫缺陷小鼠，可清除AML细胞，显示了其良好的疗效，但因CD123也表达于部分造血祖细胞，靶向CD123的CAR-T细胞亦能杀伤正常人的造血祖细胞[27]。因此，对于CAR-T细胞免疫治疗在AML患者中的应用除仍需继续寻找更加特异的肿瘤标志物外，还需积极寻找其他联合治疗方案。

对于慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia,CLL)，研究发现靶向CD19的CAR-T细胞可在体内以指数方式扩增以清除肿瘤，14例复发/难治CLL患者的总反应率达57%(8/14)，其中2例CR患者体内的CAR-T细胞免疫治疗作用可长达4年[28]，且添加CD28共刺激分子的靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗甚至对异基因干细胞移植后的复发CLL患者也显示了良好的疗效[29]。然而，对于同样为恶性B细胞肿瘤的CLL患者，靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗的疗效却低于ALL患者，可能源于其不同于ALL患者的体内微环境。

细胞内蛋白WT1过表达于多种急慢性白血病和实体肿瘤细胞中，Rafiq等[30]使用ESK1 TCRm(又称WT1 28z)作为CAR，能够特异性杀伤WT1-HLA-A*02:01阳性的多种肿瘤细胞，提示CAR-T细胞免疫治疗亦可靶向肿瘤细胞内蛋白抗原，这就为特异性肿瘤抗原的选择拓宽了思路。

2.2CAR-T细胞免疫治疗在淋巴瘤中的应用应用靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)患者显示了较好的疗效，但与治疗ALL患者疗效相比仍需优化改进[31]。Kochenderfer等[32-33]首先报道了一部分滤泡淋巴瘤(FL)患者应用靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗后可达PR，随后该课题组将靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗应用于弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者，发现4/7患者达CR，2/7患者达PR，4例CR患者中3例持续缓解9～22个月[34]。Schuster等[35]应用靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗复发/难治性NHL患者的Ⅱa期临床试验，总反应率达67%(其中12例DLBCL患者的反应率为50%，6例FL患者反应率则为100%)，中位随访6个月患者的无进展生存率为59%。

一项Ⅰ期临床试验应用靶向CD20分子的第3代CAR-T细胞免疫治疗4例复发的惰性B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤患者显示了较好疗效，2例患者持续无疾病进展期分别达12个月和24个月，且均耐受良好，无明显不良反应[36]。将靶向CD30的CAR负载于EB病毒特异性细胞毒性T细胞(EBV-CTLs)制备CD30CAR(+) EBV-CTLs，该细胞能够在霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)移植瘤模型中发挥抗肿瘤作用[37]。Mihara等[38]应用抗CD123的第2代CAR-T细胞(CD123scFv-CD127-CD3ζ)免疫治疗HL移植瘤小鼠，6个月的无复发生存率为100%。

2.3CAR-T细胞免疫治疗在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中的应用近50%的MM患者表达LeY抗原，而应用LeY-CAR-T细胞免疫治疗能够明显延迟骨髓瘤异种移植物NOD/SCID鼠中的生长[25]。Ruella等[39]应用靶向CD38、CD56的CAR-T细胞免疫治疗MM，显示了较强的细胞毒性。在78例MM患者骨髓活检样本中，免疫组化染色显示肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1表达率为9.7%，将NY-ESO-1作为肿瘤抗原设计CAR-T细胞免疫治疗，能够显著抑制抗原阳性的MM移植瘤小鼠的肿瘤生长[40]。

2.4CAR-T细胞免疫治疗在其他血液病中的应用应用Ⅷ因子的CAR(FⅧscFv-CD28-CD3ζ)修饰调节性T细胞(Treg细胞)，发现FⅧCAR-Treg细胞可诱导针对Ⅷ因子抗体的免疫耐受，提示其可能在Ⅷ因子抗体阳性的血友病A患者中具有较好的应用前景[41]。可见，应用CAR技术修饰其他免疫相关细胞可能为恶性肿瘤以外的血液病、乃至自身免疫病提供一种新的研究方向。

2.5CAR-T细胞免疫治疗在实体肿瘤中的应用基于实体肿瘤缺乏较理想的特异性表面抗原，且具有不同的免疫抑制机制，CAR-T细胞免疫治疗的疗效不及血液肿瘤(特别是B细胞恶性肿瘤)，但其在黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、间皮瘤、胰腺癌等肿瘤中取得了较好的疗效，如Morgan等[42]应用靶向人黑色素瘤标志物α-MART-1的CAR-T细胞免疫治疗17例转移性黑色素瘤患者发现，2例患者肿瘤完全消退，其余患者外周血中持续存在高比例(9%～56%)的回输T细胞，且病情稳定；Louis等[43]应用靶向神经节苷脂2(GD2)的CAR-T细胞免疫治疗19例高危神经母细胞瘤患者，11例进展期患者中3例达到CR，这些CAR-T细胞可在患者体内扩增、持续存在并与患者长期生存相关。人腺癌中过表达HER-2，应用抗-HER-2的CAR-T细胞免疫治疗19例HER-2+的肉瘤患者，未见明显与输注剂量相关的CAR-T细胞毒性，总生存期为5.1～29.1个月，中位生存期为10.3个月，其中4例患者SD达3～14个月[44]。应用间皮素特异性mRNA-CAR-T细胞免疫治疗间皮素高表达的晚期实体肿瘤患者(1例恶性胸膜间皮瘤和1例转移性胰腺癌)，也取得了较好的抗肿瘤作用[45]。另外，由于肿瘤新生血管与肿瘤的生长与转移关系密切，应用靶向新生血管中过表达的血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的CAR-T细胞进行免疫治疗，能够抑制不同的小鼠肿瘤生长，且对正常组织无明显损伤，进而发挥间接抗肿瘤作用[46-47]。

3CAR-T细胞免疫治疗的主要不良反应及应对措施

CAR-T细胞免疫治疗为包括血液病在内的多种晚期恶性肿瘤患者带来治愈希望的同时，也带来诸多不良反应，甚至一些是致命的，需要引起临床足够的重视。

3.1脱靶效应(on-target toxicity)脱靶效应常见于应用CAR-T细胞免疫治疗实体肿瘤的患者中，主要由于CAR定向的靶抗原多为肿瘤相关抗原(TAA)，其并非肿瘤细胞所特有，且在正常组织中存在不同程度的表达，因此对靶抗原亲和力强、杀伤能力强的CAR-T细胞在清除肿瘤的同时也会攻击正常组织。HER-2-CAR-T细胞可杀伤低表达HER-2的肺组织，引起致命性肺损伤[48]。靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗过程中会出现B细胞无能[49]。因此，可采取以下措施预防和治疗脱靶效应：(1)选择仅表达于肿瘤细胞而在正常细胞不表达的肿瘤特异性抗原(TSA)；(2)研发与靶抗原具有特定亲和力的CAR；(3)构建跨信号CAR，不直接相连CAR结构中的T细胞活化信号CD3ζ与共刺激信号CD28分子[50]；(4)输注丙种球蛋白治疗靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗引起的B细胞缺乏等[49]。

3.2细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)第2、3代CAR中引入了共刺激分子，使T细胞的活化、增殖、杀伤能力大幅度增强，在治疗过程中产生大量细胞因子并释放入血，引起患者恶心、头痛、心动过速、低血压、胸闷、气促等临床症状，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭[48,51]。CRS是CAR-T细胞免疫治疗过程中常见的致死性并发症，需要高度警惕，可采取以下措施进行控制：(1)研发更加安全的CAR结构并严格限制每次输注的CAR-T细胞数量；(2)适当应用糖皮质激素及细胞因子拮抗剂〔如IL-6阻断剂—塔西单抗(Tocilizumab)〕[52]；(3)在降低肿瘤负荷后应用CAR-T细胞免疫治疗。

4小结及展望

CAR-T细胞免疫治疗时应用靶向肿瘤抗原的CAR修饰T细胞，将抗原抗体的高亲和性与T细胞的杀伤效应相结合，在多种恶性肿瘤(特别是B细胞血液肿瘤)的治疗中取得了令人欣喜的疗效[21-23]，成为现今肿瘤免疫治疗的热点，具有广阔的应用前景。然而，在提升CAR-T细胞抗肿瘤能力的同时减少其不良反应等问题仍存在诸多挑战，应重视特异性肿瘤抗原的选取，CAR结构的优化改进。另外，CAR-T细胞免疫治疗与其他细胞免疫治疗技术及传统放化疗的结合，CAR-T细胞具体回输的时机、剂量、次数、抗肿瘤效应的调控、有效评估系统的界定，CAR-T细胞免疫治疗与造血干细胞移植的联合及复发患者的治疗选择等问题均需要大量的临床前研究及多中心大样本临床试验进一步研究。因此，针对这些亟待解决的问题进行深入探讨，将为CAR-T细胞免疫治疗大规模应用于血液系统恶性肿瘤提供新的思路和方向。

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(本文编辑：李婷婷)

Application of CAR-T Cell Immunotherapy in the Treatment of Hematological Malignancy

KEXiao-yan.DepartmentofHematology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191，China

【Abstract】Chimeric antigen receptor (CAR) connects single-chain variable fragment and activation motif of T cells,which allows modified T cells possess dual functions of recognizing tumor antigens in an MHC unrestricted way and killing the target cells.The intracellular structures of CAR has changed over time,from the first generation with the expression of single signal molecule,to the second and third generation adding one or two and multiple costimulatory endodomains,and to the fourth generation combining with the domains of coding CAR and/or the promoter,and suicide gene.They enhance and regulate the persistence and cytotoxicity of modified T cells.This paper summarized the available data on the principle of CAR-T cell immunotherapy,its application in the treatment of hematological malignancy,and the main adverse reactions and response measures.It was found that chimeric antigen receptor-T (CAR-T) cells have received better therapeutic effect in many types of hematological malignancy,remarkably for the CAR-T cell immunotherapy targeting CD(19);patients who adopt cell immunotherapy have prolonged survival,improved quality of life,and less adverse reactions.The main adverse reactions of CAR-T cell immunotherapy are on-target toxicity and cytokine release syndrome,which must be paid more attention.

【Key words】Hematologic neoplasms；Chimeric antigen receptor；T cell；Immnunotherapy

(收稿日期：2016-01-29；修回日期：2016-03-01)

【中图分类号】R 730.263

【文献标识码】C

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.001