袁慎俊，胡 卫，陈 涛

443002湖北省宜昌市，三峡大学医学院



·新进展·

RNA干扰在肿瘤治疗中的研究进展

袁慎俊，胡 卫，陈 涛

443002湖北省宜昌市，三峡大学医学院

【摘要】恶性肿瘤是威胁人类健康的一大杀手，目前所采取的手术、放化疗等治疗措施效果并不理想。本文介绍了RNA干扰(RNAi)的相关作用机制及其在肿瘤治疗中的应用，并叙述了RNAi用于治疗时的递送方式、引起的脱靶效应和免疫反应，提示RNAi用于治疗时存在的一些问题，通过进一步的研究，基于RNAi的肿瘤治疗有望成为一种肿瘤治疗新方法。

【关键词】RNA干扰；肿瘤治疗方案；脱靶效应；免疫反应

袁慎俊，胡卫，陈涛.RNA干扰在肿瘤治疗中的研究进展[J].中国全科医学，2016，19(12)：1367-1370，1374.[www.chinagp.net]

Yuan SJ，Hu W，Chen T.Progress of RNAi technology for cancer therapy[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1367-1370，1374.

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA(dsRNA)诱发、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi使特定基因沉默，是真核细胞中的一种转录调节机制，这种由21～23个核苷酸长度介导的小RNA常被称为小干扰RNA(siRNA)，其序列在真核生物进化中高度保守。将长dsRNA或短siRNA递送进入生物体细胞内均可引发RNAi,进而使特定基因表达沉默。RNAi能够在真核生物细胞中抑制特定基因的表达，产生类似基因敲除的作用。

肿瘤是基于RNAi治疗的主要靶点之一。许多体内外研究表明，RNAi可用于治疗单基因疾病和蛋白过度表达相关疾病[1]。在肿瘤生长、转移、血管生成和化疗等方面，通过RNAi技术沉默特殊基因的表达，许多临床前研究已经取得了可喜成果，且Ⅰ期临床研究正在进行中[2-3]。但是将基于RNAi的肿瘤治疗应用于临床，有两个关键问题亟需解决：首先，如何高效向肿瘤细胞或组织递送干扰RNA；其次，如何减少外源性siRNA引起的不良反应。

1RNAi的作用机制

基因的表达具有选择性，生物体内存在一套RNA监视系统，能通过多种途径产生异常dsRNA，进而干扰基因的表达。病毒基因、转座子、人工转入基因等外源基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时常产生一些dsRNA。对这些dsRNA，宿主细胞胞质中的核酸内切酶Dicer能够将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(21～23 bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，然后由反义链与胞内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC再与胞内特异性mRNA的同源区结合，此时RISC具有核酸酶的功能，能在结合部位切割mRNA，切割位点是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，进而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应[2](见图1)。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与同源RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer酶切割产生大量次级siRNA，进而产生RNAi的放大效应，最终将更多的靶mRNA降解。

注：dsRNA=双链RNA，siRNA=小干扰RNA，RISC=沉默复合物

图1长dsRNA被Dicer酶切割成siRNA，继而siRNA的反义链与一些酶形成RNA诱导的RISC，再由RISC切割mRNA诱导其降解

Figure 1Long dsRNA was cut into siRNA by Dicer enzyme,and antisense strand of siRNA and some enzymes formed RNA-induced silencing complex (RISC),then RISC was used to cut mRNA to induce its degradation

2RNAi在肿瘤治疗中的应用

肿瘤发生是多个基因相互调控、作用“失灵”的结果，当前对肿瘤的保守治疗主要是通过物理或化学的方法抑制DAN复制及细胞分裂增殖，进而杀死癌细胞，然而这些方法不可能完全抑制或逆转肿瘤生长。RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可使胞内多个基因同时沉默，从而促使癌细胞生长停滞。在RNAi治疗中将抑制序列选择在特定位点，可对部分有明确基因突变的癌细胞产生诱导凋亡作用。Rothdiener等[3]研究了一种脂质体siRNA载体系统，用于靶向递送siRNA到CD33阳性急性髓性白血病细胞中，其siRNA是针对t(8；21)易位导致的AML1/ MTG8融合基因，结果显示，siRNA能减少AML1/MTG8相关的mRNA和蛋白表达水平，降低急性髓性白血病细胞克隆增殖。此外，可通过使用肿瘤特异性启动子如人端粒酶逆转录酶(hTERT)、Survivin、环氧合酶2(COX-2)等引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或短发夹RNA(shRNA)进入肿瘤细胞，进而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。Xu等[4]开发了一种siRNA表达盒用于筛选高效靶向性RNA干扰序列，用于肝癌的基因治疗，8种hTERT特异性SECs(SEC-1～8)被成功构建，与阴性对照的SEC比较，hTERT特异性SECs能明显减少HepG2细胞中hTERT活性，明显降低hTERT相关的mRNA和蛋白表达水平，通过SECs下调hTERT基因表达可引起HepG2细胞凋亡。

尽管化疗药物能有效杀灭肿瘤细胞，但对肿瘤细胞靶向性较差，在应用化疗药物治疗肿瘤的同时，也会杀伤较多正常细胞。实现肿瘤细胞的靶向性同样也是以 RNAi为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。针对不同基因的RNAi可有效抑制肿瘤细胞生长，这些靶基因包括：B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Survivin、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)等。此外，RNAi还有化疗增敏作用，Zhou等[5]研究发现，蛋白激酶B(Akt)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与胃癌化疗敏感性相关，通过RNAi技术将Akt1沉默慢病毒转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823中,可显著提高细胞株对顺铂的敏感性。RNAi代替传统反义核酸进行转录后沉默基因，能高效特异地抑制目的基因表达，并且还可以根据患者不同病情，设计出个体化的治疗方案。

3RNAi的理想递送系统

由于siRNA的分子量较大和带有负电荷，不能轻易跨越癌细胞膜进入细胞内，因此将siRNA高效、特异性递送进入靶细胞或组织已成为RNAi技术的主要挑战之一。目前各种RNAi递送系统已被开发，例如纳米颗粒、基于脂质的制剂、络合聚阳离子[6]和病毒载体等，并在小鼠和非人灵长类动物模型中实验。然而，这些方法均不能将siRNA特异性递送进入癌细胞，有些siRNA只在典型应用中才起作用，或者存在细胞毒性或潜在的免疫原性。

siRNA递送的一个重要进展是成功应用适配体——RNAi的嵌合体。适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性结合。例如，适配体可与前列腺癌细胞膜表面抗原(PSMA)的胞外域特异性结合，能够高效递送siRNA靶向前列腺癌的致癌基因。给予靶向PSMA-Plk1的siRNA或靶向PSMA-Bcl2的siRNA，可以导致前列腺癌异种移植肿瘤的小鼠肿瘤缩小[7]。另一种将siRNA递送进入细胞的方法是稳定核酸脂质复合物(SNALPs)[8],对脂类复合物进行聚乙二醇(PEG)修饰使得复合物获得亲水性外层，从而增强其在血浆中的稳定性。SNALPs还可荷载siRNA和改善细胞对siRNA的摄取及胞内释放。应用SNALPs来递送siRNA，其siRNA的效应能持续>2周，诱导>90%的靶基因沉默，并且无任何毒副作用[9]。Di Martino等[10]证明胶囊化SNALPs递送miR-34a显示出了高效递送和基因调节效率，并且没有全身毒性，SNALP中的miR-34a在体内和体外均能高效抑制多发性骨髓瘤细胞生长。另一项研究发现，环磷酰胺(CTX)耦合的靶向性纳米粒子SNALPs能够选择性结合神经胶质瘤细胞，对于非肿瘤细胞不具有亲和性。此外，RNAi纳米粒子介导的miR-21沉默在体内、外能够抑制胶质母细胞瘤细胞增殖[11]。另一特异性靶向递送方式是使用鱼精蛋白抗体融合蛋白。ErbB2特异性单链抗体与鱼精蛋白融合的重组融合蛋白能够允许靶向ErbB2的siRNA进入ErbB2阳性的乳腺癌细胞[12]。注射F105-P(融合蛋白)包被的siRNAs靶向致癌基因c-myc、MDM2和VEGF,能够有效降低人类免疫缺陷病毒(HIV)表达阳性B16黑色素瘤细胞增殖，但对正常组织或HIV表达阴性B16细胞没有作用。

病毒载体通常用于递送包括慢病毒、腺病毒、双链腺相关病毒(AAVs)和疱疹病毒在内的shRNAs或miRNAs[13-14]。腺相关病毒(AAV)由于低病原性和基因持续表达的特性成为了基因运输工具。Sun等[15]揭示AAV-ARHP8病毒能够大幅度减少雄激素受体(AR)调控的胞内存活基因表达和引发凋亡反应，瘤内注射AAV-ARHP8病毒能显著抑制异种移植肿瘤的生长。大部分肿瘤细胞在基因转录时能够表达hTERT，利用hTERT能提高AAV对肿瘤细胞的靶向性,hTERT启动子引导的TRAIL基因表达能够抑制肿瘤生长，因此AAV-hTERT-TRAIL复合物将是有效的抗肿瘤药物[16]。在动物模型中，瘤内注射AAV-hTERT-TRAIL能显著抑制移植肿瘤的生长和导致肿瘤细胞凋亡[16]。此外，通过外部磁场将携带有磁性纳米粒子的药物富集在肿瘤内，可以防止纳米粒子在到达肿瘤部位之前被代谢清除，因此，携带纳米粒子的磁性靶向药物被认为是一种新的肿瘤治疗药物[17]。

还有一些新的递送系统可以提高siRNA通过全身递送系统进入肿瘤区或提高靶向肿瘤细胞的特异性和有效性，如使用PEG聚乙二醇化，肿瘤特异性配体修饰的纳米粒子结合光、热或pH敏感组件等[18]。

4RNAi存在的问题

以细胞培养为基础研究RNAi的相关药物，这些药物已用于临床，并表现出与传统药物相比极大的优势。然而，近来发现这些药物应用于临床面临着几个问题。虽然开发的许多载体系统提高了siRNA递送到靶细胞的效率，但存在一些RNAi的安全性问题，特别是脱靶效应和内在免疫反应[19]。

4.1克服RNAi的脱靶效应siRNA可引起一些非靶基因的非特异性沉默或表达上调，引起细胞凋亡或生长抑制，这种现象称为脱靶效应。脱靶效应siRNA序列进入microRNA途径，通过microRNA，干扰RNA可以不受完全互补限制而调控大量靶基因表达。原本需要19～23 nt的RNA序列完全互补才能发生干扰效应，而如果进入microRNA途径，只需要11～15 nt互补就可以产生干扰作用，这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶效应。脱靶效应发生时，与靶基因有相似序列的基因也被抑制[20]。参与这一作用的机制是靶向干扰性siRNA与特异性mRNA不完全互补[21]。从治疗观点看，脱靶效应可能会严重限制siRNA在未来作为治疗剂的应用。

解决脱靶效应的潜在方法：(1)最大限度地减少脱靶效应，包括最新发现的siRNA领域转移优化策略。配体识别细胞特异性受体可用来递送基于RNAi的药物靶向癌细胞和避免脱靶效应，因为抗体具有高亲和力和能选择性与癌组织中的生物标志物结合[22]。Burks等[23]和Zucker等[24]将重组Fab′片段连附到阿霉素脂质体制剂上用来治疗人表皮生长因子受体-2(HER-2)过表达的乳腺癌。(2)改变siRNA的浓度，Caffrey等[25]针对己糖激酶Ⅱ的siRNA治疗，发现其有浓度依赖性的脱靶效应，脱靶及其相关表型效应可减少siRNA的用量，而这些siRNA在低浓度(如1 nmol/L)时也能高效沉默靶基因。(3)siRNA设计，Xu等[26]观察到一些脱靶相关基因在多种基因的3′UTR中存在。3′UTR的脱靶相关基因可以在siRNA的设计中加以考虑，以减少RNAi治疗诱发的脱靶效应。为了验证全基因组热力学分析能够精确地识别潜在的脱靶基因和帮助减少siRNA引发的脱靶效应，Chen等[27]设计了针对3种人类基因IDH1、ITPR2和TRIM28的2种siRNA，并且其中1种基因通过全基因组热力学分析工具(Picky)预测包含有脱靶基因且能引发脱靶效应，这项研究表明经过Picky预测没有脱靶基因的siRNA不可能导致脱靶效应。因此，在siRNA的设计中Picky是必不可少的筛选步骤。

4.2克服RNAi引起的免疫反应siRNAs还是哺乳动物固有免疫系统的有力激活剂，尤其在治疗疾病时重复给药。全身给药后，siRNA双链能诱导产生高水平的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素。影响siRNA免疫识别的因素包括：敏感细胞类型、运载工具、siRNA序列和结构，并且激活固有免疫反应可引起假阳性疗效和急性毒性[28]。免疫系统由许多子白细胞构成，每个子细胞在体内均有其自身的特点和独特的位置，这为RNAi提供了一个多样的靶点，每一个靶点将是一个新的挑战和潜在的治疗策略。

为了最大限度地减少由siRNA诱发的免疫反应，可用免疫刺激的siRNA来避免诱发的相关免疫反应，因此通过选择缺乏免疫刺激基序的序列，能够设计出无免疫刺激活性的siRNA。然而，缺乏对免疫刺激RNA序列基序性质的了解，极大限制了设计出针对一个特定靶点的新siRNA序列。通过化学修饰来稳定siRNA双链是一个经典方法，可以极大减少由siRNA引起的免疫反应。Valenzuela等[29]发现用核糖修饰的方式(如2′-OMe或者 2′-F)引起免疫刺激的siRNA序列，能够减少细胞因子的产生，并且这种作用在5′端修饰比3′端更加明显。Wu等[30]的结果显示，通过靶向包含1B的GRAM域(GRAMD1B，参与化学抗性的一种蛋白质)，用2′-OMe-phosphorodithioate修饰的siRNA治疗化疗耐药卵巢癌小鼠，与紫杉醇联用可以产生协同抗肿瘤效应。减少siRNA诱发的固有免疫反应的另一种方式是通过封装方法来稳定siRNA分子。研究表明，脂质体、聚合物、微乳液和纳米凝胶、PEI(具有高阳离子电荷密度，带有多个氨基的有机分子)、CDs(a-1,4连接的吡喃葡糖基天然环状低聚物)和藻酸盐可用于包被siRNA[31]。这些方法的应用将极大减少siRNA诱发的免疫反应。

5小结和展望

RNAi是一种转录后基因沉默机制，通过RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，进而为恶性肿瘤的治疗提供一种新的思路。其优势在于简便、高效、特异。但是将基于RNAi的基础研究向临床应用转化，还存在一些问题有待解决，需要进一步研究。

由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体经济、快速、简便的以序列特异方式沉默目的基因，所以已成为探索基因功能的重要研究手段。同时大量与肿瘤发生、发展相关基因的发现，为RNAi技术应用于肿瘤治疗奠定了基础。尽管在临床应用中，RNAi治疗存在脱靶效应、免疫反应等问题，但这些问题最终会得以解决。总之，可以预测基于RNAi的肿瘤治疗在不久的将来有望成为一种肿瘤临床治疗新方法。

作者贡献：袁慎俊进行资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；胡卫进行资料收集及评估；陈涛进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

[1]Wittrup A,Lieberman J.Knocking down disease:a progress report on siRNA therapeutics[J].Nat Rev Genet，2015,16(9):543-552.

[2]Ambesajir A,Kaushik A,Kaushik JJ,et al.RNA interference:a futuristic tool and its therapeutic applications[J].Saudi J Biol Sci,2012,19(4):395-403.

[3]Rothdiener M,Müller D,Castro PG,et al.Targeted delivery of siRNA to CD33-positive tumor cells with liposomal carrier systems[J].J Control Release，2010,144(2):251-258.

[4]Xu H,Gong X,Zhang HH,et al.Targeting human telomerase reverse transcriptase by a simple siRNA expression cassette in HepG2 cells[J].Hepat Mon，2015,15(3):e24343.

[5]Zhou W,Fu XQ,Liu J,et al.RNAi knockdown of the Akt1 gene increases the chemosensitivity of gastric cancer cells to cisplatin both in vitro and in vivo[J].Regul Pept，2012,176(1/3):13-21.

[6]Kenny GD,Bienemann AS,Tagalakis AD,et al.Multifunctional receptor-targeted nanocomplexes for the delivery of therapeutic nucleic acids to the brain[J].Biomaterials,2013,34(36):9190-9200.

[7]Zhou J,Li H,Zhang J,et al.Development of cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery[J].J Vis Exp,201 (52):2954.

[8]de Antonellis P,Liguori L,Falanga A,et al.MicroRNA 199b-5p delivery through stable nucleic acid lipid particles (SNALPs) in tumorigenic cell lines[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2013,386(4):287-302.

[9]Dyawanapelly S,Ghodke SB,Vishwanathan R,et al.RNA interference-based therapeutics:molecular platforms for infectious diseases[J].J Biomed Nanotechnol,2014,10(9):1998-2037.

[10]Di Martino MT,Campani V,Misso G,et al.In vivo activity of MiR-34a mimics delivered by stable nucleic acid lipid Particles (SNALPs) against multiple myeloma[J].PLoS One,2014,9(2):e90005.

[11]Costa PM,Cardoso AL,Mendonça LS,et al.Tumor-targeted chlorotoxincoupled nanoparticles for nucleic acid delivery to glioblastoma cells:a promising system for glioblastoma treatment[J].Mol Ther Nucleic Acids,2013(2):e100.

[12]Dou S,Yao YD,Yang XZ,et al.Anti-Her2 single-chain antibody mediated DNMTs-siRNA delivery for targeted breast cancer therapy[J].J Control Release,2012,161(3):875-883.

[13]Veesler D,Cupelli K,Burger M,et al.Single-particle EM reveals plasticity of interactions between the adenovirus penton base and integrin αVβ3[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(24):8815-8819.

[14]Hu P,Li Y,Sands MS,et al.Generation of a stable packaging cell line producing high-titer PPT-deleted integration-deficient lentiviral vectors[J].Mol Ther Methods Clin Dev，2015(2):15025.

[15]Sun A,Tang J,Terranova PF,et al.Adeno-associated virus-delivered short hairpin-structured RNA for androgen receptor gene silencing induces tumor eradication of prostate cancer xenografts in nude mice:a preclinical study[J].Int J Cancer,2010,126(3):764-774.

[16]Wang Y,Huang F,Cai H,et al.The efficacy of combination therapy using adeno-associated virus-TRAIL targeting to telomerase activity and cisplatin in a mice model of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(12):1827-1837.

[17]Tietze R,Lyer S,Dürr S,et al.Efficient drug-delivery using magnetic nanoparticles——biodistribution and therapeutic effects in tumour bearing rabbits[J].Nanomedicine,2013,9(7):961-971.

[18]Kim B,Wang S,Lee JM,et al.Synthetic lethal screening reveals FGFR as one of the combinatorial targets to overcome resistance to Met-targeted therapy[J].Oncogene，2015,34(9):1083-1093.

[19]Hannus M,Beitzinger M,Engelmann JC,et al.SiPools:highly complex but accurately defined siRNA pools eliminate off-target effects[J].Nucleic Acids Res,2014,42(12):8049-8061.

[20]Yilmazel B,Hu Y,Sigoillot F,Smith JA,et al.Online GESS:prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis[J].BMC Bioinformatics,2014(15):192.

[21]Kalleda N,Naorem A,Manchikatla RV.Targeting fungal genes by diced siRNAs:a rapid tool to decipher gene function in Aspergillus nidulans[J].PLoS One,2013,8(10):e75443.

[22]Heine M,Freund B,Nielsen P,et al.High interstitial fluid pressure is associated with low tumour penetration of diagnostic monoclonal antibodies applied for molecular imaging purposes[J].PLoS One,2012,7(5):e36258.

[23]Burks SR,Macedo LF,Barth ED,et al.Anti-HEr2 immunoliposomes for selective delivery of electron paramagnetic resonance imaging probes to HER2-overexpressing breast tumor cells[J].Breast Cancer Res Treat，2010,124(1):121-131.

[24]Zucker D,Andriyanov AV,Steiner A,et al.Characterization of PEGylated nanoliposomes co-remotely loaded with topotecan and vincristine:relating structure and pharmacokinetics to therapeutic efficacy[J].J Control Release，2012,160(2):281-289.

[25]Caffrey DR,Zhao J,Song Z,et al.siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency[J].PLoS One,2011,6(7):e21503.

[26]Xu W,San Lucas A,Wang Z,et al.Identifying microRNA targets in different gene regions[J].BMC Bioinformatics,2014,15(Suppl 7):S4.

[27]Chen X,Liu P,Chou HH.Whole-genome thermodynamic analysis reduces siRNA off-target effects[J].PLoS One,2013,8(3):e58326.

[28]Sioud M.Overcoming the challenges of siRNA activation of innate immunity:design better therapeutic siRNAs[J].Methods Mol Biol,2015,1218：301-319.

[29]Valenzuela RA,Suter SR,Ball-Jones AA,et al.Base modification strategies to modulate immune stimulation by an siRNA[J].Chembiochem,2015,16(2):262-267.

[30]Wu SY,Yang X,Gharpure KM,et al.2′-OMe-phosphorodithioate-modified siRNAs show increased loading into the RISC complex and enhanced anti-tumour activity[J].Nat Commun,2014(5):3459.

[31]Bhavsar D,Subramanian K,Sethuraman S,et al.EpCAM-targeted liposomal si-RNA delivery for treatment of epithelial cancer[J].Drug Deliv,2015(14):1-14.

(本文编辑：李婷婷)

Progress of RNAi Technology for Cancer Therapy

YUANShen-jun，HUWei，CHENTao.TheMedicalCollegeofThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China

【Abstract】Malignant tumors are a major threat to human health,and at present the primary types of treatment such as surgery,radiation and chemotherapy do not have a good effect.This text introduced the mechanism of RNA interference (RNAi) and the application of RNAi technology in cancer therapy,described drug delivery methods of RNAi in the therapy,RNAi-induced off-target effects and immune response.Although problems still exist in the treatment by RNAi,RNAi-based cancer therapy may be a new method for the clinical treatment of cancer by further research.

【Key words】RNA interference；Antineoplastic protocols；Off-target effects；Immune response

(收稿日期：2015-11-29；修回日期：2016-01-26)

【中图分类号】R 730.5 R 394.114

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.002

通信作者：陈涛，443002湖北省宜昌市，三峡大学医学院；

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81173612)

E-mail：chentao@ctgu.edu.cn