瞿国英 综述，郁爱平 审校

(上海潍坊社区卫生服务中心检验科，上海 200122)



·综述·

外周血游离DNA作为肿瘤标志物的临床展望和生物学意义*

瞿国英 综述，郁爱平△审校

(上海潍坊社区卫生服务中心检验科，上海 200122)

关键词:CFDNA;肿瘤标志物;基因改变

早在1977年，即有科学家发现在癌症患者血浆和血清中循环游离DNA(CFDNA)异常增高[1]。然而直到近期，人们才意识到癌症患者外周血CFDNA可以作为癌症早期诊断和预后的标志物，并加以研究。至今，已发现在多种类型肿瘤患者中，包括结直肠癌、胰腺癌、肺癌等，CFDNA出现特征性基因改变，包括点突变、微卫星不稳定、DNA超甲基化、杂合子缺失等[2-5]。多项研究表明，CFDNA的变化与肿瘤原发部位基因改变完全相同。虽然，CFDNA的基因改变与数量上升不能鉴别特定肿瘤，但是处于肿瘤晚期且发生转移的患者往往伴有CFDNA的显著升高。因此，利用CFDNA传递的遗传信息，对肿瘤患者进行早期分子诊断和预后评估，具有潜在临床价值。

1CFDNA的特征与起源

CFDNA在健康人外周血浓度平均值为30 ng/mL。推定每个细胞DNA水平为6.6 pg，则1 mL血中平均含有5 000个DNA基因组。在系统红斑狼疮、关节炎、肝炎、癌症患者外周血中，CFDNA常表现为高水平。癌症患者外周血CFDNA平均值为180 ng/mL[4-6]。CFDNA为双链，常与蛋白结合成为核蛋白复合物，但是目前复合物的具体成分还不清楚[7]。对CFDNA实行低百分率琼脂糖凝胶电泳分析，显示0.18～21.00 kbp的DNA片段在标本间差异最大。CFDNA在血液中清除速率极快，它对DNAse.1等血浆核酸酶极为敏感。但是肝脏和肾对CFDNA的生理清除作用还未彻底阐明。胎儿分娩后，对母体中胎儿CFDNA的清除研究表明，CFDNA的半衰期为16.3 min[8]。如果肿瘤患者CFDNA的半衰期类似母体中胎儿CFDNA的清除率，那么每小时必须有数百万个DNA基因组释放入血才能维持血中CFDNA浓度达到180 ng/mL。这个数目看似巨大，但与同时机体内新陈代谢更新的细胞相比，只占很小一部分。

CFDNA的肿瘤起源说的产生是因为在肿瘤患者的肿瘤位点和CFDNA发现了原癌基因和抑癌基因发生相同突变。与此结果相符的是，肿瘤患者CFDNA的生物物理特性与肿瘤细胞极为相似。肿瘤患者的CFDNA经体外致癌物处理后，相比正常DNA双链稳定性下降，健康志愿者的CFDNA同样处理后却与正常DNA一样保持双链稳定。

源自肿瘤的CFDNA占全部CFDNA比例在个体间差异极大。Jahr等[9]通过定量PCR发现外周血中肿瘤CFDNA占全体CFDNA的比例维持在10%～90%，肿瘤比例最高者总体CFDNA较低。但是，Hibi等[10]的研究却表明肿瘤CFDNA所占比例相当低(为0.2%～10.0%)。这些差异有可能反映肿瘤状态(组织学、肿瘤起源、分级、大小)也可能是技术问题(外周血标本处理、CFDNA分离、突变检测)。肿瘤的位点、组织学、分级分期对于CFDNA有很大影响，然而目前还缺乏合适的数据系统比较不同类型肿瘤之间CFDNA的差异。高水平的CFDNA并不能特异反映肿瘤，因为其他炎症病理状况，如肝硬化、肝炎、系统性红斑狼疮都会出现CFDNA的升高。所以，确定肿瘤特异的遗传改变是评估CFDNA肿瘤起源的最好办法。

2CFDNA释放入血的机制

游离DNA释放入血的生物机制目前仍不明晰。目前研究人员主要提出了2种主要机制：一是凋亡和坏死；二是完整细胞释放入血并发生裂解。

肿瘤位点发生凋亡和坏死都较为频繁。凋亡细胞具有特征化的DNA片断典型模式(“凋亡阶梯”)。在某些情况下，CFDNA表现出凋亡细胞才有的阶梯模式。但是，大片段甚至接近全基因组大小的DNA片段也常能检测到。对DNA特定大小片段进行定量PCR发现，血浆中完整DNA的量相比正常人有升高。近期，Diehl等[11]发现，发生DNA突变的大多为小片段，而大片段大多为野生型。据此，他们提出突变DNA来自坏死细胞经巨噬细胞消化后的产物。按照这个理论，突变CFDNA的水平应该与肿瘤坏死的程度相一致。但是也有报道发现在前列腺癌、乳腺癌、肝癌患者中有完整细胞释放入血。值得注意的是，这些细胞并非转移细胞，它们仅仅能够进入血液而不能侵袭其他器官，它们在血液中的降解产物构成了CFDNA的大片段。Anker等[12]提出细胞会主动分泌DNA，以核蛋白复合物的形式入血。该假说基于培养细胞基质中出现新合成的双链DNA。许多附加实验表明DNA释放进入基质并不受到细胞周期的影响。然而，目前仍然缺乏数据阐明DNA主动分泌的机制。

目前对于CFDNA在机体内发挥何种生物学功能还不确定。有人提出释放入血、发生基因突变的CFDNA可能会重新进入细胞发挥功能。它会整合进入细胞并改变接受细胞的遗传信息。这种学说甚至导致了“基因组转移”概念的提出。认为肿瘤DNA具有改变远端器官中干细胞基因组的潜在能力。

3外周血CFDNA的检测方法

CFDNA可由酚/氯仿或者商业化离子交换试剂盒抽提获得。已有多种高灵敏度方法检测血浆或血清中的CFDNA。其中包括竞争性放射免疫测定，灵敏度可达25～1 000 ng/mL，以及对经切口翻译纯化的DNA进行直接放射标记(灵敏度可达1.6 ng/mL)。DNA嵌入染料，如SYBR Green，Hoechst等，灵敏度还无法达到检测微量DNA的水平。利用免疫测定检测组蛋白和双/单链DNA已有商业化试剂盒(Cell Death Detection plus-EILSA，Roche,Mannheim,Germany)，但是试验结果无法与其他方法比较确定敏感性。现在，最简单、最适宜进行CFDNA浓度测定的方法还是应用特异结合于DNA双链的染料(PicoGreen,Molecular Probes,Inc,Eugene,OR)，能够检测到25 pg/mL的双链DNA[13]。

早期，人们采用微卫星分析检测CFDNA中等位基因变化，发现与肿瘤DNA具有较高一致性。然而，必须考虑到源自肿瘤的CFDNA只占了全部CFDNA中很小一部分，肿瘤DNA等位基因改变在野生型的大背景下难以检测得到。通过附加PCR测定微卫星不稳定可检测到CFDNA中0.1%～0.2%的不稳定DNA。CFDNA基因点突变的检测，如TP53、KRAS2，相比肿瘤组织需要更加精密的方法。在很多情况下，直接基因测序的灵敏度并不能保证，因为它无法检测到野生型基因背景下小于25%的突变信号。后来出现了2种改进方法，一种是限制性位点突变(RSM)，对DNA先进行限制性酶消化后再行PCR。另一种是限制性片段长度多态性(RFLP)，即PCR完成后再进行限制性内切酶消化。但是这两种方法只能检测到限制性酶切位点特异的点突变，无法大量应用[14-16]。最近，人们应用2种较高灵敏度的方法定量检测特定位点的突变，分别是短片断寡核苷酸质谱分析(SOMA)和乳胶颗粒扩增磁性(BEAMing)。在SOMA方法中，通过PCR和酶消化产生突变点周围的小DNA片段，然后根据HPLC-电喷离子质谱确定特征。一项在非洲冈比亚的病例对照研究采用SOMA检测突变CFDNA，TP53基因在249位丝氨酸突变在肝细胞癌患者中位数水平较高(2 800 copy/mL，范围500～11 000 copy/mL)，肝硬化和健康者中位数水平均为500 copy/mL。249位丝氨酸突变对于鉴别诊断肝细胞癌具有统计学意义[17]。在BEAMing方法中，第一轮PCR的产物经标记转移到颗粒上，然后对于突变位点进行单碱基延伸，使得野生型与突变型和不同的荧光染料结合，最后进行流失细胞术分析。该方法对晚期结直肠癌患者定量分析发现，血浆中APC突变平均值为5 300 copy/mL[18]。

对于非特定位点突变的检测，大部分研究倾向于从采用预先筛选法。比如变性高压液相色谱(DHPLC)、时间温度梯度电泳(TTGE)、单链构相多态性(SSCP)。这些方法的灵敏度范围为3%～50%(根据突变的位置和类型)，因此只适合在肿瘤CFDNA所占比例较大时检测突变[19]。

4CFDNA与临床研究

肿瘤患者体内CFDNA相比健康人有升高使得CFDNA成为肿瘤早期诊断和预后评估的有用工具。然而，目前还无法确定CFDNA应用于筛选的临床决定浓度。而且CFDNA浓度与患者实际的临床、生物学、组织学特征之间的联系还未建立起来。比较有希望的是检测基因改变的CFDNA应用于早期诊断或预后评估。突变CFDNA检测早于传统肿瘤诊断的例子还不多。对49例支气管镜检查疑似肺癌患者的CFDNA测定中，Allan等[20]发现有13例可检测到杂合子缺失，其中有2例，遗传改变的CFDNA检测早于肿瘤诊断几个月。所以，对于一些传统方法难以检测的肿瘤，遗传改变的CFDNA可能是有用工具。CFDNA的浓度变化和遗传改变也可作为疾病治疗后监测复发的有用标志。研究发现临床症状的改善往往伴有CFDNA浓度下降。有多项研究表明，肿瘤治疗后患者CFDNA的基因改变，如KRAS2突变、多位点微卫星不稳定、CDKN2A的超甲基化，可反映疾病的复发程度。在一项大规模的结直肠癌患者回访研究中，Ryan等[21]发现血清中KRAS2突变对于疾病复发具有91.0%的灵敏度、88.0%的特异度、62.5%的阳性预测值。

在过去的10年中，对CFDNA的多项研究使得它成为认识肿瘤的有用工具。然而，进一步的临床应用和群体研究还需要更深入了解DNA释放入血的机制，CFDNA与疾病进展的联系基本问题。目前而言，CFDNA作为肿瘤标志物的优势在于它可以经非侵入性方法获得，患者痛苦较少，操作性好，结构稳定，易于保存。缺点在于特异性较差(遗传改变的CFDNA无法反应肿瘤类型和部位)，而且在非肿瘤患者中也会出现CFDNA的改变。进一步研究工作应该是寻找并确定具有最大预后和诊断价值的遗传改变，以发挥优点克服不足。

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(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.033

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)09-1234-03

*基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科研课题计划项目(201440470)。

作者简介：瞿国英，女，副主任检验技师，主要从事临床检验方向的研究。△通讯作者，E-mail：172327959@qq.com。