周婧婷 综述，戴启宇 审校

(1.新乡医学院研究生院,河南新乡 453000；2.中国人民解放军第三七一中心医院检验科,河南新乡 453000)



·综述·

循环肿瘤细胞富集检测的研究进展

周婧婷1综述，戴启宇2△审校

(1.新乡医学院研究生院,河南新乡 453000；2.中国人民解放军第三七一中心医院检验科,河南新乡 453000)

关键词:循环肿瘤细胞；富集检测方法；纳米技术

恶性肿瘤的复发和转移是导致肿瘤患者死亡的重要原因。目前临床上仍主要通过影像学检查及传统肿瘤标志物的检测来发现并诊断肿瘤，发现时患者常常已处于肿瘤进展晚期，影响患者预后[1]。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原发或转移肿瘤病灶脱落，进入外周血的肿瘤细胞，与肿瘤的转移密切相关，其检测具有重要的临床意义，不仅有助于实时监测肿瘤动态、早期发现肿瘤微转移，还能为评估预后和疗效以及肿瘤的个体化治疗提供可靠参考[2]。近年来纳米技术在CTCs的富集检测中得到广泛应用，本文对常用的CTCs富集检测方法以及相关研究进展进行总结，并对纳米技术在CTCs检测中的应用进行探讨。

1CTCs的生物学特性及其检测的临床意义

CTCs主要表达上皮源性表面标志，存在于大多数上皮来源的恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤中[3]。虽然CTCs在血液中水平极低，但是CTCs检测是评估临床预后及化疗疗效的重要指标。

2现有CTCs富集和检测的方法学

外周血CTCs取材方便，重复性强，可实时监测癌细胞动态，相比较骨髓来说，是更为理想的检测标本来源。外周血中白细胞水平较高，而CTCs的浓度极低，这就对其检测分析技术提出了较高要求。现有的方法学主要分为CTCs分离富集方法和CTCs检测鉴定方法两大类[4]。

2.1CTCs分离富集方法

2.1.1物理富集方法物理富集方法是基于CTCs和血细胞之间直径、密度、变形性、介电性质等物理学特性的不同而建立的方法。目前最常用的CTCs富集方法为膜滤过分析法和密度梯度离心法。这两种方法分别根据CTCs直径和密度与其他血细胞的差异，通过滤膜过滤法和离心法将CTCs分离出，并用于进一步的检测鉴定。基于CTCs物理学特性的富集方法操作简便，但特异度低，得到的CTCs纯度较低，且存在被漏检的可能[5]。细胞变形性富集法是利用肿瘤细胞的恶性程度增加，变形性增加这一特性而设计的一种微流体装置进行细胞分离富集的方法。目前该方法应用于临床仍有一定的困难。细胞电学特征富集法是根据细胞介电性质的不同而建立的分离富集方法。该方法具有活细胞分选、使用灵活、容易调控、便于自动化、可重复使用的优点。但是由于各种肿瘤细胞的介电性质不同，无法对所有肿瘤进行检测。肿瘤细胞的尺寸和表面电荷与正常细胞存在差异，ApoStreamTM技术利用这一点通过改变电场频率来捕获CTCs[6]。ApoStreamTM技术的CTCs检出率明显高于CellSearch系统，有报道称，ApoStreamTM技术检出的CTCs数超过CellSearch系统的10倍以上[7]。

2.1.2生物富集方法生物富集方法是基于CTCs和普通血细胞之间某些生物标志物的表达差异而建立的方法。免疫磁性分离技术是目前最常用的CTCs分离富集方法[8]，其原理是形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，通过外加磁场作用使该复合物发生移动，达到分离细胞的目的，主要有阳性富集和阴性富集两种[9]。CellSearch系统是目前唯一获得美国FDA的批准应用于临床检测CTCs的新技术[10]。该技术通过上皮细胞黏附分子Ep-CAM标记磁珠从而对上皮细胞进行富集，目前已用于检测结直肠癌、前列腺癌和转移性乳腺癌CTCs[11]。该方法与免疫细胞化学技术、RT-PCR、流式细胞术(FCM)等方法相结合检查CTCs，可提高检测敏感度和特异度。CellSearch系统具有很好的重复性[12]，可以很好地保存细胞形态结构。缺点则是操作较为复杂，技术要求和检测成本均较高。采用上皮细胞标志筛选将遗漏发生上皮间质转化(EMT)的肿瘤细胞，造成结果的假阴性[13]。有研究者发现，增加的标记分子在提高CTCs检出率的同时，其与正常细胞的特异性反应和非特异性反应也会增加，所以要求增加的标记分子特异度好、具有一定代表性[14-15]。

2.2CTCs检测鉴定方法

2.2.1FCMFCM通过检测细胞标记的荧光信号，从而实现高速、逐一的细胞定量分析和分选[16]。FCM可作为诊断癌前病变发展至癌变的一个重要标志，精确定量DNA水平的改变，对癌前病变的性质及发展趋势做出评估，有助于癌变的早期诊断。FCM的优点是可以定量计数肿瘤细胞，可精确定量DNA水平。缺点是敏感度较低，检测价值依赖于可分析细胞数量。

2.2.2免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术方便、直观，在细胞富集的基础上，利用抗原抗体特异性结合的原理，对肿瘤细胞进行检测及鉴定，但敏感度低，特异度较差。

2.2.3RT-PCRRT-PCR以上皮源性肿瘤细胞的mRNA为标志检测CTCs，灵敏度高，价格较低，可重复操作，是目前检测CTCs最有效的方法。缺点是无法计数，缺乏一定的特异度，易造成假阳性结果，在临床应用上仍有局限性。

3纳米技术在CTCs富集检测中的应用

早期免疫磁珠技术磁珠大小只达到微米级，细胞分离效率较低，磁珠较难洗脱，不利于进一步分析。随着技术的发展，磁珠的大小达到了纳米级(10～100 nm)[17]，使其与细胞的接触概率增加，大幅度提高了CTCs的富集率。但是捕获了CTCs的纳米磁珠易聚集，会影响细胞的形态及活性，不利于进一步分析检测。

基于上述技术的缺点，非磁性纳米材料在CTCs富集中的应用开始得到关注。研究者们将抗体功能化的不同形状的纳米材料固定在基底上富集CTCs，提高了细胞与纳米材料的接触概率。捕获到的CTCs细胞较易洗脱，减少了对细胞形态及活力和进一步分析检测的影响，从而进一步提高了CTCs细胞的富集率和检测灵敏度，实现了CTCs富集检测的一体化。

有研究者利用血细胞与肿瘤细胞在纳米粗糙表面的不同黏附特性实现CTC的分离富集[18]。随着粗糙度的增加，肿瘤细胞的黏附增多，而正常细胞不受影响。避免了因特异性抗原丢失所导致的假阴性结果，提高了检测的准确性。

血液中CTCs水平相对于白细胞来说极少，这便成为CTCs富集检测中的首要困难。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度高等特点。有研究者将纳米材料与微流控技术相结合[19]，构建一种肿瘤细胞表面特异性识别抗体功能化的鱼骨形芯片，使血液流过一个可视通道，通道内鱼骨形沟回能够引起血液的一个轻微斡旋，从而增强了其与抗体修饰表面的接触。该技术不用对血液样本进行预处理，操作方便，灵敏度更高，且获得的CTCs仍能够保持活性，用于进一步分析检测。

4CTCs富集检测在临床应用存在的问题和前景

CTCs检测是一种新型的诊断工具，属于非侵入性操作，但也有一定的弊端。如外周血中CTCs数量稀少，且具有异质性、易聚集成团。已有微流控技术与纳米材料联合应用的相关研究[20]，寻找新的特异性标志或多种检测技术的联合应用是必然的发展趋势。随着技术的发展进步，已经研究出可观的新方法，但是关于CTCs的临床实用性的评估仍是必不可少的，还需要建立规范的实验流程使其标准化。CTCs检测技术成本较高也是需要解决的一个重要问题。随着研究的不断深入和未来科技的发展，CTCs检测势必在临床肿瘤的诊治过程中得到广泛应用，其检测的同时所伴随的问题也会不断的改进与解决，其检测方法的更加高效、经济、快速是必然的趋势。

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(收稿日期：2015-12-24)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.035

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)09-1239-02

作者简介：周婧婷，女，在读研究生，主要从事循环肿瘤细胞检测的研究。△通讯作者：E-mail：dqy716@sohu.com。