张苗苗，陆　栋，剡　倩，郭晓鹏，李文建*

（1.中国科学院 近代物理研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃 兰州 730000）

细胞膜对酿酒酵母乙醇耐受性影响的研究进展

张苗苗1，2，陆栋1，2，剡倩1，郭晓鹏1，李文建1，2*

（1.中国科学院 近代物理研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃 兰州 730000）

酿酒酵母因其发酵工艺成熟主要被用于燃料乙醇生产及酿造行业。然而发酵过程中乙醇积累对酵母细胞的毒害是限制乙醇产量的主要因素之一，乙醇积累引起的细胞膜变化是研究酵母细胞乙醇耐受性的重要方面。该文介绍了乙醇对酵母细胞膜的作用机理，以及膜脂质，膜蛋白，膜特性与乙醇耐受性之间的关系，提出了细胞膜在酵母乙醇耐受方面所起的重要作用。

酿酒酵母；细胞膜；膜脂质；膜蛋白；膜特性；乙醇耐受性

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为单细胞真核生物的代表，发酵工艺成熟，生物安全性高，主要用于燃料乙醇、白酒、葡萄酒、啤酒等的酿造生产中。细胞膜作为生物与外界环境接触的屏障，具有维持细胞内环境稳态，确保物质正常运输的功能。物理刺激或物质诱导会改变细胞膜脂质组成，影响膜蛋白酶活性，引起膜通透性、完整性等生理特性发生变化，从而导致细胞功能发生变化。就酿酒酵母而言，细胞膜改变与酵母细胞乙醇耐受性之间有着重要联系。本文主要综述了酿酒酵母细胞膜脂质组成，膜蛋白酶H+-ATPase活性及膜生理特性的变化与酵母乙醇耐受性之间的联系，为进一步提高酿酒酵母乙醇耐受性及研究微生物细胞膜变化对其生理生化功能的影响提供基础依据。

1　乙醇对酿酒酵母细胞膜的作用机理

一般认为，在乙醇生产过程中，不断升高的乙醇含量会破坏酵母细胞膜的构造，导致膜通透性增加、完整性降低，最终引起胞内核酸泄露，膜蛋白酶失活，质子梯度被破坏，运输系统崩溃，最终使酵母细胞死亡［1］。在较高乙醇含量存在环境下，酵母细胞膜脂质成分对细胞乙醇耐受性起决定性作用；并且在乙醇胁迫条件下，酵母会通过改变细胞膜脂质成分使细胞膜流动性发生改变，从而对乙醇胁迫做出应答［2-3］。酵母细胞膜脂质的主要构成成分——磷脂性脂肪酸及麦角固醇的含量被认为是解析乙醇耐受性的重要因素。脂肪酸组成水平上的改变包括：1）脂肪酸饱和度和酰基长度的调整：一些乙醇耐受性酵母菌株本身在生长过程中就可以合成较多的长链不饱和脂肪酸，维持膜原有流动性，增加菌体乙醇耐受性［4］；2）脂肪酸的异构化：在酵母不支持脂肪酸重新合成的情况下，脂肪酸的异构化在不涉及双键易位或转换，不需要能量输入的情况下通过改变顺、反式脂肪酸的比例对抗细胞膜通透性的增加，顺式脂肪酸有弯曲的构型，与不饱和脂肪酸类似，赋予膜的流动性；反式脂肪酸有一定的刚性，可以像饱和脂肪酸一样，插入膜的内部，增加膜的非流动性［5-6］。麦角固醇是酵母细胞固醇类中最主要的一种化合物，它能增加细胞膜的稳定性，调节细胞膜的流动性，在细胞膜上形成障碍物降低乙醇进入细胞的通透性［7］。

2　细胞膜与乙醇耐受性

细胞膜具有屏障作用，骨架为脂类双分子层。磷脂、糖脂、固醇等是生物膜的主要脂类，它们含有亲水基团（磷酸、胆碱、丝氨酸或乙醇胺等）和疏水基团（大多是脂酰基），膜蛋白结合于脂双层中。细胞膜中的磷脂脂肪酸、糖脂、固醇及各组分的比例，膜蛋白H+-ATPase的活性，细胞膜通透性及完整性等变化均会对细胞乙醇耐受性产生重要影响。

2.1脂肪酸对酵母乙醇耐受性的影响

在培养基中加入一定量的脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸，其可以被酵母细胞所吸收，融合到细胞膜和线粒体膜中，结果发现这些酵母细胞在乙醇发酵过程中乙醇耐受力有很大提高［8］。YOUK M等［9］通过研究不饱和脂肪酸对酵母乙醇耐受性的影响，也证实了相对于9-十六碳稀酸（C16∶1），油酸（C18∶1）融合于细胞膜后会降低细胞膜流动性，抵消乙醇对细胞膜的流化作用；在培养基中添加油酸、棕榈酸、硬脂酸在提高乙醇耐受性的同时还会增加乙醇产量，其中硬脂酸效果最明显［10］；在自絮凝颗粒酵母培养基中添加棕榈酸、亚油酸或亚麻酸，发现酵母细胞膜中不但富含各自所添加的脂肪酸，并且细胞膜富含棕榈酸的细胞具有较强的乙醇耐受性［11］，而酵母细胞培养于同时添加脂肪酸和乙醇的培养基中时，细胞乙醇耐受能力明显提高［12］。

有些酵母细胞自身在生长过程中可以合成较多的长链不饱和脂肪酸，使细胞乙醇耐受性提高，CHEN S等［13］的研究结果显示，经过乙醇耐受性传代驯化的酿酒酵母，乙醇耐受性较高的酵母菌株脂肪酸总量无显著变化，但是脂肪酸组成变化明显，耐受性较高的驯化菌株细胞膜中油酸和亚油酸含量高，肉豆蔻酸含量低，并且C18/C16比例也相对较高。脂肪酸作为磷脂的非极性尾部，不管是自身生长过程中合成还是外源添加脂肪酸。融入到酵母细胞膜，均被证实可提高酿酒酵母乙醇耐受性。到目前为止，面对高浓度乙醇胁迫或乙醇对酵母细胞膜造成损伤时，酵母细胞是通过自身合成还是摄取外源脂肪酸将其融入细胞膜抵御乙醇毒害的过程还不清楚。在后续研究中，对这部分工作展开深入探讨可为实际生产提供丰富的参考。

2.2膜脂质对酵母乙醇耐受性的影响

膜脂包括磷脂、鞘脂和固醇类等，除了磷脂和鞘脂脂肪酸会对酵母乙醇耐受性产生影响外，糖脂、固醇含量及其他组成基团的变化也会改变酵母细胞乙醇耐受性。

脂类变化的规律如下：1）磷脂的含量和组分方面，磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）通过影响H+-ATPase活性改变酵母细胞膜通透性。限制肌醇含量，H+-ATPase活性下降；当与肌醇合成相关的inol基因缺失时，胞内肌醇含量下降酵母乙醇耐受性降低［14］；2）糖脂的含量和组分方面，对乙醇的适应改变表现为总糖脂量上升，糖脂中的唾液酸、己糖胺含量下降，脑苷脂、硫苷脂、单葡萄糖甘油二酯含量上升；构成糖脂的糖基中葡萄糖含量升高，乳糖含量下降；当酵母处于乙醇胁迫环境下，脑苷脂和硫苷脂在膜物理结构稳定方面发挥着重要作用［15］；3）固醇的含量和组分方面，培养基中添加麦角固醇后，不但能促进酵母生长，提高乙醇产量［16］，而且当酿酒酵母细胞膜中含有丰富的麦角固醇或豆甾醇时比含有菜油甾醇或胆固醇时乙醇耐受性更强［17］，麦角固醇含量越高，菌体乙醇耐受性越强［18］。推测麦角固醇可以增加细胞膜的坚韧性，减少膜的流动性［19］。与乙醇敏感型的工业酵母菌相比，产高浓度乙醇的酵母在有氧分批培养过程中不仅能合成较多的麦角固醇，而且在应对高浓度乙醇冲击时，死亡速率明显慢于乙醇敏感型酵母，这说明麦角固醇与酵母耐高浓度乙醇有密切关系［20］；4）质膜各组分比例关系方面，在高渗透条件下，乙醇耐受性高的酵母细胞膜中麦角固醇/磷脂高；磷脂酰胆碱（phosphatidyl cholines，PC）/磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）高；长链脂肪酸比例高；不饱和脂肪酸比例略高［21］，细胞膜的这些变化均可增加菌体乙醇耐受性。

2.3膜蛋白对酵母乙醇耐受性的影响

H+-ATPase是一种重要的酵母膜蛋白，其功能是伴随着ATP水解，参与将质子泵出质膜外，形成跨膜质子梯度，推动物质运输。在啤酒酿造企业，H+-ATPase的活性一直作为评价酵母活力及质量的重要参数用于指导实际生产［22］。ROSEA M F等［23］比较了马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和酿酒酵母H+-ATPase的活性，发现马克思克鲁维酵母生长于体积分数7%乙醇时与酿酒酵母生长于体积分数10%乙醇时，H+-ATPase的活性接近，均为200 nmol Pi/（min·mg），证明了H+-ATPase活性相同时，酿酒酵母的乙醇耐受性强于马克思克鲁维酵母。针对酿酒酵母的研究发现，当细胞膜H+-ATPase活性增强时，可以消减乙醇对跨膜质子流的影响［18］，提高菌体乙醇耐受性；同时也有研究表明，采用体积分数15%乙醇对絮凝酵母进行休克处理，发现H+-ATPase活性处于较高水平的絮凝酵母，乙醇耐受性也有所提高［24］。以上研究均表明，H+-ATPase活性对酵母乙醇耐受性有重要影响，而通过在培养基中添加Cu2+或者药物处理酵母细胞，可提高H+-ATPase活性［25-26］，所以在常规的酒精生产企业或者酿酒行业均可通过提高膜H+-ATPase活性，降低乙醇浓度积累对酵母细胞的损害，提高生产效率。酵母细胞乙醇耐受性除了与H+-ATPase活性有关外，还与细胞膜中蛋白质氨基酸组成相关。HU C K等［27］研究发现，SPSC（Schizosaccharomyces pombeandSaccharomyces cerevisiae）酵母融合株生长于异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸的混合液时，以上氨基酸组进入菌体细胞膜后会降低膜流动性，维持细胞膜稳态，提高菌体乙醇耐受性，揭示了膜蛋白质氨基酸组成与膜流动性及菌体乙醇耐受性之间的关系。

2.4膜特性对酵母细胞乙醇耐受性的影响

通透性是细胞膜的重要功能之一，是细胞与环境之间物质交换、能量转换和信号传导的重要保证。人为的改变细胞膜通透性，可以改变原料的输入和代谢产物的输出速率，主要目的是使代产物在胞外积累，使代谢朝着人们希望的方向进行，是实现代谢人工调控的重要方法之一［28］。酵母细胞膜通透性受膜脂组成和膜H+-ATPase活性的影响［29］，膜通透性的改变会影响菌体乙醇耐受性。HU CK等［30］研究发现通过向发酵培养基中添加3.5 mmol/L的Mg2+可降低自絮凝酵母融合菌株SPSC细胞膜通透性，提高菌体乙醇耐受性。酵母细胞膜通透性的大小与菌体乙醇耐受性强弱成反比关系，膜通透性越大，乙醇耐受性越弱［31］，能够更好维持细胞膜完整性的酵母乙醇耐受性更强［32］。文中2.1也提到，细胞膜流动性的降低会降低乙醇对细胞膜的流化作用，提高菌体乙醇耐受性。

3　结语与展望

本文从脂肪酸、膜脂、膜蛋白及膜特性几个方面总结了它们对酵母乙醇耐受性的影响作用。这几个方面相互关联、相互影响，如脂肪酸变化会引起膜脂变化，膜脂变化会增加或降低膜蛋白暴露于水相的部分，影响蛋白酶活性；膜脂和膜蛋白的组成和结构变化进一步决定了膜流动性、通透性、完整性的变化。所以，研究酿酒酵母细胞膜对菌体乙醇耐受性的影响已不在局限于单一方面。近年来，随着基因组学，分子生物学，计算生物学等技术的发展，对酵母乙醇耐受性机理的研究已迈入基因表达调控，代谢通路，信号转导甚至几个方面的相互影响等领域，酿酒酵母乙醇耐受性的研究热点和研究成果将不断涌现［33］。目前，燃料乙醇作为清洁能源已开始代替有限的石化能源［34］，而酵母因其乙醇产率高和乙醇耐受性强成为燃料乙醇及酿酒行业生产中的首选微生物。在实际生产中，可根据细胞膜对酿酒酵母在葡萄酒、啤酒、乙醇发酵中产生乙醇耐受性的影响研究［35］，通过物理诱变选育，培养条件优化，生产原料改良等技术方法显著提高酵母乙醇耐受性，提高生产效率，推动酿酒行业和燃料乙醇生产企业的发展。

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Research progress on effect of cell membrane on ethanol tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

ZHANG Miaomiao1，2，LU Dong1，2，YAN Qian1，GUO Xiaopeng1，LI Wenjian1，2*
（1.Institute of Modern Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；2.Key Laboratory of Microbial Resources Exploition and Application，Lanzhou 730070，China）

Saccharomyces cerevisiaewas mainly used in fuel ethanol production and brewing industry for its mature fermentation technology.However，the toxic of ethanol accumulation onS.cerevisiaecell was one of the main factors limiting ethanol yield during fermentation process，and cell membrane change caused by ethanol accumulation was an important research aspect of ethanol tolerance of yeast cells.The paper introduced the action mechanism of yeast on ethanol，the relationship between cell membrane lipids，membrane protein，membrane properties and ethanol tolerance，and the important role that cell membrane on ethanol tolerance was put forward.

Saccharomyces cerevisiae；cell membrane；membrane lipids；membrane protein；membrane properties；ethanol tolerance

Q93-3

0254-5071（2016）09-0016-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.004

2016-03-08

中国科学院科技服务网络计划（STS计划）项目（KFJ-EW-STS-086）

张苗苗（1986-），女，助理研究员，硕士，研究方向微生物辐照育种与辐射生物学。

李文建（1959-），男，研究员，博士，研究方向生物物理学。