刘大群 陈文烜 华 颖

(浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，杭州 310021)

青贮是保存饲料作物及牧草采后营养成分的一种常用方法，其基本原理是利用好气性微生物和植物细胞本身的呼吸作用使青贮窖内尽快形成厌氧环境，然后乳酸菌在厌氧条件下将饲料中的可溶性糖发酵成以乳酸为主的有机酸，形成酸性厌氧环境从而抑制有害微生物的生长使饲料的营养成分得以保持［1］。

竹笋加工过程中会产生大量的废弃物，主要为笋壳。据统计，笋肉与笋壳(含笋蒲头、下脚料)的比例约为 5.5∶4.5，仅新鲜笋壳年产量就达1 570万t，产量巨大。鲜笋壳营养丰富，与鲜笋的营养成分基本相同，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，并富含19种微量元素和15种游离氨基酸，还含植物甾醇、多糖、黄酮类、酚等多种生物活性物质［2］。据文献报道，笋壳中粗蛋白质(CP)含量高于玉米秸秆、小麦秸、稻秸等秸秆饲料，稍低于小麦麸，粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、粗灰分(ash)、钙(Ca)、磷(P)含量与玉米秸秆等常见粗饲料相近［3］。经过蒸煮后的笋壳含水量高，在高温高湿环境中极易腐败变质，不处理会污染环境，且其具有坚硬的外壳，特别是笋蔸比例高的笋壳，也无法直接饲喂动物。对笋壳进行青贮发酵，近年来成了研究者们感兴趣的研究课题。王力生等［4］通过添加不同种类的青贮剂研究其对笋壳青贮品质和营养价值的影响。也有研究者通过添加麦麸、稻秆的同时添加氨水、尿素、碳酸氢铵进行氨化青贮［5］，为笋壳饲料的开发做了一些尝试。本研究参考贾燕芳等［6］的方法并加以改进，以10%的麦麸为发酵介质，为便于青贮发酵过程中同型发酵和异型发酵同时进行，以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Lc)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，Lp)为发酵菌株，分析不同乳酸菌配比和乳酸菌混合液接种量以及对竹笋废弃物干物质(DM)损失的影响，研究不同处理方式对竹笋废弃笋壳青贮效果的影响，以期确定竹笋废弃物青贮的条件，为有效利用笋壳开发青贮饲料提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

笋壳:新鲜竹笋经蒸煮加工后剩下的副产物(笋壳、笋头)，由杭州富阳千禧笋厂提供，其主要营养成分如下(g/kg，DM 基础):DM 134.6、粗灰分 49.2、CP 33.4、可溶性碳水化合物(WSC)34.1、NDF 748.0、酸性洗涤纤维(ADF)384.1、粗纤维(CF)60.3、EE 2.7、磷 0.3、钙 0.3。麦麸:浙江省农业科学院畜牧研究所提供。

1.1.2 试验菌株

干酪乳杆菌、植物乳杆菌各1株，引自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

1.1.3 主要仪器

气相色谱仪:GC－14A，日本岛津(Shimadza)公司;手持式色差仪:CR－400，日本柯尼卡美能达公司;数显电热培养箱:HPX－9162－MBE，上海博讯实业有限公司;UDK－127型高效凯式定氮仪:嘉盛(香港)科技有限公司;真空封口机:DZQ－400/500，温州市兄弟包装食品机械有限公司;TM－3000型扫描电镜:日本日立(HITACH)公司;冷冻干燥:FD－1C－5，北京博医康仪器有限公司;超低温冰箱:MDF－192，日本三洋电机株式会社。药品均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 青贮用乳酸菌混合液的筛选

1.2.1.1 菌株的活化与培养

将保存于冰箱中的植物乳杆菌、干酪乳杆菌取出，待恢复至常温后分别接种于制备完成的MRS液体培养基上活化1～2次，然后将活化后的菌株再次分别接种于MRS液体培养基中，于35℃条件下培养24～36 h，当菌数密度≥109CFU/g后作为乳酸菌液备用。

1.2.1.2 笋壳原料的处理

将竹笋加工废弃物干燥至含水量为70%～80%，然后分切至2～3 cm。

1.2.1.3 乳酸菌配比筛选

将1.2.1.1活化后的植物乳杆菌、干酪乳杆菌菌液分别以 1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1 的配比混合，按照干燥后的竹笋废弃物的15%添加，搅拌均匀后，用真空包装机脱气密封于真空聚乙烯袋中青贮，每袋2 kg，重复3次，每隔15 d取样1次测DM含量，计算DM 损失率，共青贮90 d。

1.2.1.4 乳酸菌混合液接种量筛选

以1.2.1.3得出的最佳配比，按照干燥后的竹笋废弃物质量的5%、10%、15%、20%添加乳酸菌混合液，搅拌均匀后，按照1.2.1.3的方法进行青贮。

1.2.2 添加乳酸菌混合液和麦麸的青贮

确定的最佳乳酸菌混合液配比和添加水平后，笋壳(处理同 1.2.1.2)分别添加 10% 麦麸、15%乳酸菌混合液(干酪乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1，菌数密度≥109CFU/g)、10%麦麸+15%乳酸菌混合液进行青贮，以不添加麦麸和乳酸菌的笋壳单独青贮为对照。青贮90 d后，开袋检测。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 常规营养成分

按常规方法［7］测定笋壳青贮前后DM和CP含量，采用 Van Soest等［8］的方法测定 NDF 和ADF含量，按Dubois等［9］方法测定WSC含量。

1.3.2 有机酸和氨态氮(NH3-N)

按《青贮饲料质量评定标准(试行)》［10］制取浸提液后，采用 pH计测定 pH，并采用 GB/T 6432—1994测定青贮笋壳的NH3-N/总氮(TN)。

乙酸、丙酸、丁酸、乳酸含量用气相色谱法测定。色谱条件:氢火焰离子化检测仪(FID);分析柱为PEG20M，弹性石英毛细管柱内径0.53 mm，液膜厚度0.25μm，30 m长;柱温220℃，汽化室、检测器温度260℃;氮气流速0.5 kg/cm2，氢气流速 0.6 kg/cm2，空气流速 0.5 kg/cm2;分流比为30 ∶1。

1.3.3 感观评价

笋壳经青贮后，感官性状评价参考《青贮饲料质量评定标准(试行)》［10］进行，采用色差计进行色泽测定。L*值表示明亮程度［11］(0 ～100)，数值越大表示越亮。a*正值表示红色，正值越大红色越深;负值表示绿色，负值越小则绿色越深。b*正值表示黄色，正值越大黄色越深;负值表示蓝色，负值越小则蓝色越深。△E值表示所测样品与鲜笋壳之间的色差值，其公式为:

式中:L、a、b为新鲜笋壳颜色测定值，L*、a*、b*为处理后的笋壳颜色测定值。

以上每个处理方式取样3次，每样不同角度旋转3次分别读数，取9次读数的平均值。

1.3.4 表面结构观察

依笋壳青贮情况，挑选颜色为黄色、有光泽、质地松软的青贮笋壳进行试验。根据笋壳的大小、部位等选取基本相同的，切取中央面积(0.5～1.0)cm×(0.5 ～1.0)cm、厚约1 mm 的笋壳。将笋壳放在载玻片上并放入－70℃超低温冰箱冷冻，真空冷冻干燥24 h后将笋壳用导电胶黏固定在样品台中央，在SBC－12型离子溅射仪上喷镀金属膜，制成扫描电镜样品，然后将样品移入扫描电镜观察、拍照，方法参照文献［12］。

1.4 数据统计分析

利用SPSS 17.0和 Origin 8.0软件进行数据统计分析及作图，数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，显著水平为 P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 笋壳青贮用乳酸菌混合液的筛选

2.1.1 菌株配比

由表1可知，接种乳酸菌后，DM损失率随着发酵时间的增加而增加。当青贮15 d时，不同菌株配比对DM损失率的影响基本相当，之后DM损失率差距开始逐渐拉大。当植物乳杆菌∶干酪乳杆菌=1∶1时，相比于其他4种配比DM损失率增加较为平缓，青贮发酵DM损失率最小。单菌株青贮DM损失率都要高于组合复配菌株。所以试验选取植物乳杆菌∶干酪乳杆菌=1∶1为最佳配比。

2.1.2 乳酸菌混合液接种量

由表1可知，不同乳酸菌混合液接种量的DM损失率总体趋势均随着青贮时间的延长而增加。4个接种量中，接种量5%的DM损失率最大，这可能是由于接种量小，乳酸菌没有快速的成为优势发酵菌，杂菌的生长利用了DM。另外，接种量5%和10%之间的差异总体要低于15%和20%之间的差异，4个处理在青贮90 d后DM损失率基本相当。综合考虑，选择15%为乳酸菌混合液接种量。

表1 不同菌株配比和乳酸菌混合液接种量对笋壳青贮过程中DM损失率的影响Table 1 Effects of different proportions of bacteria and inoculation levels of LAB mixture on DM loss rate of bamboo shoots shell during silage %

2.2 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳常规营养成分含量的影响

由表2可见，经90 d厌氧发酵，相比于对照，另外3个处理青贮笋壳中DM、WSC含量均显著下降(P＜0.05)，而添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液青贮以上含量最低，CP含量显著高于对照(P＜0.05)。这说明经过90 d的青贮发酵，添加麦麸增加营养成分含量的同时，随着乳酸菌的大量繁殖，乳酸菌能够利用较多的WSC，而导致了DM的损失。另外，经过90 d青贮发酵后，相比于对照，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理也显著降低了NDF含量(P＜0.05)，ADF 含量有降低趋势(P＞0.05)，而单独添加10%麦麸只显著降低了NDF含量(P＜0.05)，ADF含量显著增加(P＜0.05)。

表2 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳常规营养成分含量的影响(干物质基础)Table 2 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on common nutrient composition contents of bamboo shoots shell silage(DM basis) g/kg

2.3 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳有机酸和NH 3-N含量的影响

由表3可知，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理pH最低，显著低于其他处理(P＜0.05)。对照处理中NH3-N/TN显著高于其他处理(P＜0.05)，丁酸含量也显著高于其他处理(P＜0.05)，对照处理乳酸含量显著低于其他处理(P＜0.05)，15%乳酸菌混合液、10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理乳酸含量较高。这说明笋壳以乳酸菌发酵为主。

表3 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳有机酸和氨态氮含量的影响(干物质基础)Table 3 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on organic acid and NH3-N contents of bamboo shoots shell silage(DM basis)

2.4 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳表面结构的影响

笋壳微生物发酵预处理后其细胞壁成分被降解，会导致笋壳表面的物理结构发生变化。如图1所示，不同处理笋壳表面结构也不同。未经微生物预处理的青贮笋壳(对照)的表面结构紧密规整，结构致密，而试验处理青贮笋壳厌氧发酵后笋壳表面都出现了锯齿蚀痕，特别是添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理的，其表面结构已被破坏，存在很多的裂缝和孔洞。

2.5 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳感官评价的影响

由表4可知，各处理的青贮笋壳亮度L*值、红度a*值和黄度b*值有较大变化。其中，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理b*值最大，颜色黄，对照处理L*值最小，所以颜色偏黑。同时对△E值的分析可看出，各处理之间有显著差异(P＜0.05)。相比于新鲜笋壳，色泽指标均发生了较大的变化，10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理△E值最小。

图1 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳表面结构的影响Fig.1 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on surface structure of bamboo shoots shell silage(5 000×)

表4 添加乳酸菌混合液和麦麸对青贮笋壳感官评价的影响Table 4 Effects of supplementation of LAB mixture and wheat bran on sensory evaluation of bamboo shoots shell silage

3 讨论

3.1 乳酸菌混合液对青贮笋壳DM损失率的影响

DM回收率是评价青贮饲料质量的重要指标，在保证青贮饲料的色泽、气味和质地结构良好的前提下，DM回收率越高，也就是DM损失越少，说明青贮料发酵过程中碳水化合物等营养物质的降解越少。据 Whiter等［13］研究报道，在青贮过程中，对DM含量高的青贮原料，发酵菌株以液体形式添加比以固体形式添加更加有效，且液体发酵添加形式比固体发酵添加形式乳酸菌生长更快，发酵产生的乳酸更多，pH下降的更快。本试验中，在接种不同乳酸菌发酵菌株以及不同接种量后，DM损失率随着青贮发酵时间增加都有明显的增加，且接种量5%的DM损失率最大。这可能与不同青贮发酵阶段微生物活动有关。在青贮发酵后期，由于乳酸菌的大量积累，其在厌氧、微酸性环境和较低温度的条件下生长繁殖旺盛，通过利用原料中丰富的碳水化合物作为碳源产生乳酸、醋酸、丁酸等酸类物质，减少了由于杂菌发酵而引起的DM损失。另外，本试验中按植物乳杆菌∶干酪乳杆菌=1∶1接种时，DM损失率最小，这可能是在青贮过程中同型发酵和异型发酵同时进行，一定程度上可以保证营养和提高有氧稳定性［14］。因此，乳酸菌能否快速地成为优势发酵菌，从而有效地遏制不耐酸的腐败菌生长是青贮饲料能否成功的关键。

3.2 乳酸菌混合液对笋壳青贮品质的影响

经过蒸煮后的笋壳青贮含水量高，WSC含量低，这一特点将不利于笋壳直接进行青贮。而WSC是青贮饲料发酵过程中乳酸菌繁殖发酵的基质，在原料中足够的WSC可确保乳酸菌快速大量地形成乳酸，促使pH迅速下降，有效地抑制不良发酵，提高青贮的品质和成功率。在青贮饲料中，pH、NH3-N/TN和有机酸含量是评定品质优劣的重要指标。一般认为pH、NH3-N/TN和有机酸中丁酸含量越低，乳酸占总有机酸比例越高，说明青贮过程中乳酸菌发酵占优势，青贮料品质就好［15］。添加高密度的乳酸菌可以保证在青贮的初期发酵所需的乳酸菌数量，增加乳酸含量，能尽快让青贮原料进入乳酸发酵阶段，从而pH迅速下降，减少青贮饲料中NH3-N/TN，影响蛋白质分解作用，而降低丁酸含量，提高青贮饲料发酵品质和适口性。本试验中，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理降低了NDF和ADF含量的同时，显著降低了青贮饲料pH、NH3-N/TN及丙酸含量，丁酸的含量大幅下降而乳酸的含量大幅提高。这可能由于添加外源乳酸菌直接增加了乳酸菌数量，从而抑制其他杂菌的繁殖生长，减少青贮原料的蛋白质消耗，同时加快了乳酸菌对可溶性糖类的分解利用。

3.3 乳酸菌混合液对笋壳青贮感官评价的影响

在青贮饲料调制完成后，应当正确地评定其营养价值和发酵质量。在生产实践中常常采用一些简单而直观的方法来判断青贮质量，例如pH、色泽、气味和质地等。品质优良的青贮通常具有轻微的酸味和水果香味(由于存在乳酸所致);霉变说明压得不实，空气进入了青贮容器(或青贮堆)内，引起饲料霉变;陈腐的脂肪臭味以及令人作呕的气味，说明产生了很多丁酸［16］。本试验中，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理与对照处理从青贮料感官性状、色差值以及表面结构结果来看，差异均较明显。相比于对照处理笋壳的褐色、散发氨味、有渗滤液等感官性状，添加10%麦麸+15%乳酸菌混合液处理具有散发酸香味、质地松软且保持完整、无黏手现象、色泽为黄色等特点。这一结果与《青贮饲料质量评定标准(试行)》［10］以及《青贮词料的合理调制与质量评定标准》［16］中青贮饲料的气味、颜色、质地综合评定相吻合。

4 结论

添加15%植物乳杆菌∶干酪乳杆菌为1∶1的混合液以及10%的麦麸能改善笋壳青贮品质，可以获得较理想的青贮笋壳饲料，青贮笋壳呈亮黄色，散发酸香味，质地松软，无黏手现象。

［1］ 管武太，ASHBELL G，HEN Y，等.微生物添加剂对青贮高粱发酵品质和稳定性的影响［J］.中国农业科学，2002，35(11):1401－1405.

［2］ 余能富，王玉.我国笋壳开发利用进展［J］.江西林业科学，2010(4):51－53.

［3］ 赵丽萍，周振明，任丽萍，等.笋壳作为动物饲料利用研究进展［J］.中国畜牧杂志，2013，49(13):77－80.

［4］ 王力生，齐永玲，陈芳，等.不同添加剂对笋壳青贮品质和营养价值的影响［J］.草业学报，2013，22(5):326－332.

［5］ 周建钟，刘力，冯炎龙.氨化竹笋加工下脚料饲用价值研究［J］.竹子研究汇刊，2001，20(4):52－56.

［6］ 贾燕芳，石伟勇.不同添加剂对笋壳青贮发酵品质的影响［J］.浙江农业科学，2011(2):341－343.

［7］ AOAC.Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists［S］.Washington，D.C.:AOAC，1990.

［8］ VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.Journal of Dairy Science，1992，74:3583 －3597.

［9］ DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28(3):350－356.

［10］ 浙江大学动物科学学院.青贮饲料质量评定标准(试行)［J］.中国饲料，1996(21):5－8.

［11］ PEI F，SHI Y，MARIGA A M，et al.Comparison of freeze-drying and freeze-drying combined with microwave vacuum drying methods on drying kinetics and rehydration characteristics of button mushroom(Agaricus bisporus)slices［J］.Food Bioprocess Technology，2014，7(6):1629－1639.

［12］ 郜海燕，杨帅，陈杭君，等.蓝莓外表皮蜡质及其对果实软化的影响［J］.中国食品学报，2014，14(2):102－108.

［13］ WHITER A G，KUNG L，Jr.The effect of a dry or liquid application of Lactobacillus plantarum MTD1 on the fermentation of alfalfa silage［J］.Journal of Dairy Science，2001，84(10):2195－2202.

［14］ 刘海燕，于维，邱玉朗，等.秸秆青贮添加乳酸菌的研究进展［J］.饲料广角，2011(20):40－44.

［15］ DONG X L，MENG Q X，XIONG Y Q.A comparison of buffered propionic acid and Propionibacterium acidipropionici as additives for high oil maize stover silage［J］.Journal of Animal and Feed Sciences，2006，15(4):669－683.

［16］ 刘建新，杨振海，叶均安，等.青贮饲料的合理调制与质量评定标准(续)［J］.饲料工业，1999，20(4):3－6.