任海亮，马信龙，马剑雄

关节置换术后患者血浆乙酰肝素酶的变化的研究

任海亮1，2，马信龙2，马剑雄2

目的：分析关节置换手术前后血浆乙酰肝素酶水平和活性，探究其与术后循环系统高凝状态的关系。方法：50例膝关节炎行关节置换治疗的患者，在手术前1 h、手术后1 h、手术后1周、手术后1个月留取血浆，检测乙酰肝素酶水平和促凝活性、组织因子(tissue factor,TF)活性、TF/乙酰肝素酶复合体的活性、Xa因子和凝血酶的水平。结果：乙酰肝素酶在手术后1 h和1周较手术前显著升高（P＜0.05）；与手术前相比，乙酰肝素酶促凝活性手术后1 h增到(1.29±0.46)，手术后1周增加到(2.20±0.74)；Xa因子和凝血酶没有显著增加。结论：乙酰肝素酶在关节置换术后1个月内均有较高活性，与关节置换术后高凝状态有关。监测乙酰肝素酶的促凝活性和适当延长低分子肝素抗凝治疗，可减少血栓事件的发生。

乙酰肝素酶；促凝；关节置换术

血栓形成是髋、膝关节置换术后常见的并发症之一[1]，虽然常规进行抗凝治疗，亚临床血栓发生率在手术结束24 h之内仍然高达15%～20%，其中在手术3个月后有2%～4%发展为有临床症状的血栓[2]。虽然血栓形成主要发生在下肢，血栓脱落仍可引起肺栓塞等并发症，严重威胁着病患的生命。酰肝素酶是一种β-D-葡糖苷酸内切酶，具有裂解硫酸乙酰肝素侧链的作用[3-4]。乙酰肝素酶的活性受到诸多因素的影响，如感染、血管生成、创伤愈合和肿瘤生长[5-6]。有人对活性位点变异而失活乙酰肝素酶进行研究，发现失去酶活性的乙酰肝素酶仍然与组织重塑、新生组织血管生成和细胞侵润有关的非酶促活动[7-8]。乙酰肝素酶还可以通过作用于非酶促过程影响凝血系统，上调组织因子（tissue factor，TF）并在细胞表面与组织因子抑制剂（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）相互作用，使TFPI从内皮细胞和肿瘤细胞膜上分离，导致细胞表面凝血活性的增加[9-10]。Nadir等[11]证明，乙酰肝素酶可以直接增加TF/VIIa因子的活性，提升凝血系统的活性。乙酰肝素酶的表达主要在胎盘、角化细胞、血小板和白细胞，在结缔组织细胞和大多数正常上皮细胞中很少或不表达[5-6]。Li等[12]利用乙酰肝素酶活性测定、免疫印迹和RT-PCR，发现在风湿性关节炎患者的关节滑膜组织和滑液中，乙酰肝素酶是呈现高表达的。2012年7月—2013年7月，我院对行髋、膝关节置换术的50例患者检测其手术前后血浆乙酰肝素酶水平和活性，以探究其与术后循环系统高凝状态的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料本组共50例骨性关节炎行膝关节置换术。纳入标准：对抗凝血药无不良反应，无心脑血管病史，血常规检查指标正常。关节置换术后6～8 h接受依诺肝素(50～90 kg，40 mg/d；＞90 kg,60 mg/ d)治疗，在安全范围内持续5周。在术前1 h、术后1 h、术后1周、术后1个月采集外周血6 mL，以3.2%柠檬酸钠抗凝。除术前和术后1 h外，采集血液均在依诺肝素注射后24 h进行。4℃1500 g离心，获得血浆，-80℃保存。

1.2试剂和抗体乙酰肝素酶促凝活性检测 25 μL血浆与50 μL测序缓冲液（0.06M缓血酸胺，0.04M NaCl，2 mM CaCl2，0.04%牛血清白蛋白，pH值=8.4）、人重组VIIa因子（0.04 μM）和人血浆源性X（1.4 μM）混合，共同加入125 μL 96孔板。置于37℃15 min，加入1 mMXa荧光底物。孵育20 min，加入50 μL冰醋酸终止反应。记录Xa生成量作为TF+乙酰肝素酶活性。再次进行上述步骤，在测序缓冲液中加入磺达肝癸。第2次测得Xa生成量作为TF的活性。前后2次检测结果的差值作为乙酰肝素酶促凝活性。

1.3乙酰肝素酶ELAISA检测2 μg/mL乙酰肝素酶单克隆抗体与50 μL包被液（0.05M Na2CO3,0.05M NaHCO3,pH值=9.6）混合在96孔板中，置于4℃18 h。2%牛血清白蛋白PBS溶液在37℃封存1 h。取200 μL样品，室温下孵育2 h，加入100 μL乙酰肝素酶抗体（1 μL/mL），继续室温下孵育2 h。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶20000）加入封存液中（1 h，室温），加入50 μL发光染料30 min。加入100 μH2SO4在450 nm吸收光下测量。

1.4Xa因子和凝血酶荧光检测50 μL血浆加入50 μL Tris缓冲液（0.06M，pH值=8.4）和25 μL Xa显色剂（5 mM）或25 μL凝血酶显色剂（5 mM），30 min后用冰醋酸停止反应，在405～490吸光度下用酶标仪测量。

1.5统计学分析将手术前水平作为参考值定义为1，其他时间点的结果与手术前水平比较，得出相对值。所有数据用平均数±标准差的形式记录。利用SPSS进行T检验对数据进行差异性分析，P＜0.05被认为有统计学差异。

2　结果

2.1血浆乙酰肝素酶水平和促凝活性乙酰肝素酶水平在手术后1 h开始升高，手术后1周达到峰值（2.47±0.63），并直到手术后1个月持续保持增高水平（表1）。TF/乙酰肝素酶活性在手术后1周与手术前相比显著性最明显（t=2.851,P＜0.05），到手术后1个月没出现明显下降（表2）。在手术后1 h和手术后1周，TF/乙酰肝素酶中起主要作用的是乙酰肝素酶。在1个月后，TF的活性在TF/乙酰肝素酶复合体中起主要作用（表3～表4）。

2.2血浆Xa因子和凝血酶水平和TF活性增加相一致，Xa因子和凝血酶在手术后1个月增加至（1.17±0.44），只有Xa因子手术后1个月的水平与手术前相比存在显著性差异（t=3.682,P＜0.05）（表5～表6）。

表1　乙酰肝素酶水平

表2　各时间点TF+乙酰肝素酶活性

表3 各时间点TF活性

表4　各时间点乙酰肝素酶促凝活性

表6　各时间点凝血酶水平

2.3亚组分析将关节炎和创伤患者进行比较，所有凝血指标均没有统计学差异。将髋关节置换和膝关节置换患者进行比较，所有凝血指标也不存在统计学差异。

2.4临床血栓形成事件本组2例血栓形成发生。1例70岁，女性，体重69 kg，患有高血压20年。因骨性关节炎行膝关节置换术，术后无并发症，2周后如期出院。术后1个月带拐下地行走，自述疼痛减轻。依诺肝素5周后停药。在术后第6周，因肺栓塞再次入院。凝血测试显示，术后第4周有明显乙酰肝素酶促凝血活性增高，与基础值相比高出8倍。在术后1个月，平均乙酰肝素酶促凝血活性是基础值2倍。1例63岁，女性，体重60 kg，乳腺癌术后化疗。因外伤致股骨颈骨折行半髋关节置换术，术后2周后如期出院。手术后1个月下地独立行走。5周后停用依诺肝素。术后第6周因术肢深静脉血栓再次入院。凝血测试乙酰肝素酶促凝血活性在术后1个月有基础值的2倍，TF活性是基础值的4倍，Xa因子和凝血酶增高9倍（同时期的平均值增高了1.7倍）。

3　讨论

骨科手术是血栓形成的一个重要风险因素[12]。有文献显示，乙酰肝素酶在骨性关节炎患者的关节滑液或滑膜组织中高表达。关节滑液进入体循环，很可能是导致乙酰肝素酶在手术后1 h显著升高的重要因素。在手术1周后，随着创伤修复成为主导过程，乙酰肝素酶也处于较高水平。有趣的是，手术1个月后，乙酰肝素酶水平和促凝血活性依然处于显著增高的水平，但这时在TF/乙酰肝素酶复合体中起主要作用的是TF。TF活性受一些因素的影响[13-14]，其一是伴随分泌的TF内源性抑制剂TFPI，另一个是细胞的定位和结构修饰[15-16]。随着对TF/乙酰肝素酶复合体的认识[11]，加之量化乙酰肝素酶在复合体中作用的可能，对于临床操作影响TF活性的认识也越来越深刻。根据本文的结果，尽管由于手术操作对组织和内皮细胞的损伤使TF的活性在术后1 h显著升高，但之后TF活性没有再出现显著变化。此外，手术1个月之后，TF活性的增加，可能意味着在伤口愈合的过程中，乙酰肝素酶作为复合体的另一个组成成分主要在早期反应中增加活性，当纤维化成为主导时，延迟性的TF活性增加。1周和1个月的样品都是在依诺肝素注射24 h后采取的，低剂量依诺肝素的作用在之前还不是很明确。低剂量的依诺肝素可潜在降低TF/乙酰肝素酶的活性，这意味着没有依诺肝素处理组的结果会更加显著。此外，如先前的研究[17]所示血浆X因子的水是0.14 μM，在测序时是外源性的X因子水平增加了10倍，进一步降低了依诺肝素的抗凝血酶的作用。

下肢骨折后常继发凝集反应，这种凝集反应表现为凝血酶原片段1+2（prothrombin fragment 1+2，F1+2），凝血酶-凝血酶原（thrombin-antithrombin，TAT）复合体和纤维蛋白降解产物升高[18]。这种在手术之前就升高的凝血酶原片段1+2、凝血酶-凝血酶原和D-二聚体增加了血栓形成的风险[19]。手术1周抗血栓治疗停止后，随即升高的血浆凝血酶-凝血酶原复合体和D-二聚体水平可以预测深静脉血栓的发生[20]。Siemens等[21]在4种不同的手术后，评估凝血和纤溶参数包括凝血酶-凝血酶原复合体、D-二聚体、纤维蛋白溶酶源激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1），抗凝血酶和C反应蛋白的水平。进行全髋关节置换的患者，术后接受低分子量肝素的预防性治疗，凝血功能的变化最为明显。凝血系统在手术后1～2 h达到最大激活程度，之后逐渐降低，在术后第5 d时恢复到正常水平。其中变化最大的是凝血酶-凝血酶原复合体和D-二聚体。与此相反，López等[22]比较腹部手术和骨科手术患者在接受低分子量肝素预防性治疗后的凝血标志物，在手术前、手术后1、3、7 d采集样品，选取F1+2、凝血酶-凝血酶原标志物、纤维蛋白肽A、组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，TPA）、PAI-1、纤维蛋白溶酶-抗纤溶酶复合物和FDP，凝血指标在术后较术前显著升高并持续至术后第7 d。Cofrancesco等[23]发现，在全髋关节置换后，尽管采取抗凝治疗，但血浆F1+2、凝血酶-凝血酶原复合体和D-二聚体水平在术后1、3、6 d均高于正常水平。在我们的研究中，第1周内凝血酶和Xa因子没有显著变化，有可能表明这些下游的凝血产物可能不足以代表抗凝-凝血平衡，可能是由于这些分子的半衰期较短。

增加的乙酰肝素酶水平，可能代表内源性患者合成乙酰肝素酶和伤口愈合的能力，不同的乙酰肝素酶水平与促凝活性的关系，可能部分归功于最近发现的乙酰肝素酶基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）。Ostrovsky等[24]发现，犹太人的基因型和等位基因频率与非犹太人群不同，除了与高加索人有一定的相似性。该小组还证实，乙酰肝素酶基因单核苷酸多态性与血液系统恶性肿瘤的相关性[25]。Ralph等[26]报道了一个特定的乙酰肝素酶的SNPs和卵巢癌分期的相关性，但没有发现血管内皮生长因子的SNPs与卵巢癌分期的相关性。需要今后进一步的研究，来探讨乙酰肝素酶基因多态性的血栓风险评估的临床意义。

目前，手术后停止预防性抗凝药物的时间还没有做到个体化。在本研究中，发生血栓的2例都在术后1个月开始下地活动，并没有症状或体征来预测血栓，乙酰肝素酶和TF的升高水平要比整组增长的平均值高。我们只能推测，如果这种检测TF/乙酰肝素酶的方法能常规在术前和手术1个月后，那么这2例的依诺肝素就不会在术后1周停止。

我们目前的工作是第一次证明乙酰肝素酶在骨科手术的涉及。利用乙酰肝素酶促凝血活性的检测来评估骨科手术后血栓形成的潜在风险，需要在今后大规模的研究中进一步检验。

[1]Migita K,Bito S,Nakamura M,et al.Venous thromboembolism af⁃ter total joint arthroplasty:results from a Japanese multicenter co⁃hort study[J].Arthritis Res Ther,2014,16(4):R154.

[2]Geerts WH,Bergqvist D,Pineo GF,et al.Prevention of venous thromboembolism:American College of Chest Physicians Evi⁃dence-Based Clinical Practice Guidelines(8th Edition)[M].Chest, 2008,133(6 Suppl):381S-453S.

[3]Freeman C,Parish CR.Human platelet heparanase:purification, characterization and catalytic activity[J].Biochem J,1998,330 (Pt 3):1341-1350.

[4]Pikas DS,Li JP,Vlodavsky I,et al.Substrate specificity of hepa⁃ranases from human hepatoma and platelets[J].J Biol Chem, 1998,273(30):18770-18777.

[5]Parish CR,Freeman C,Hulett MD.Heparanase:a key enzyme in⁃volved in cell invasion[J].Biochim Biophys Acta,2001,1471(3): M99-108.

[6]Vlodavsky I,Friedmann Y.Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J].J Clin In⁃vest,2001,108(3):341-347.

[7]Gingis-Velitski S,Zetser A,Flugelman MY,et al.Heparanase in⁃duces endothelial cell migration via protein kinase B/Akt activa⁃tion[J].J Biol Chem,2004,279(22):23536-23541.

[8]Zetser A,Bashenko Y,Edovitsky E,et al.Heparanase induces vas⁃cular endothelial growth factor expression:correlation with p38 phosphorylation levels and Src activation[J].Cancer Res,2006,66 (3):1455-1463.

[9]Nadir Y,Brenner B,Zetser A,et al.Heparanase induces tissue fac⁃tor expression in vascular endothelial and cancer cells[J].J Thromb Haemost,2006,4(11):2443-2451.

[10]Nadir Y,Brenner B,Gingis-Velitski S,et al.Heparanase induces tissue factor pathway inhibitor expression and extracellular accumu⁃lation in endothelial and tumor cells[J].Thromb Haemost,2008, 99(1):133-141.

[11]Nadir Y,Brenner B,Fux L,et al.Heparanase enhances the genera⁃tion of activated factor X in the presence of tissue factor and acti⁃vated factor VII[J].Haematologica,2010,95(11):1927-1934.

[12]Li RW,Freeman C,Yu D,et al.Dramatic regulation of heparan⁃ase activity and angiogenesis gene expression in synovium from pa⁃tients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2008,58(6):1590-1600.

[13]Steffel J,Akhmedov A,Greutert H,et al.Histamine induces tissue factor expression:implications for acute coronary syndromes[J]. Circulation,2005,112(3):341-349.

[14]Camera M,Giesen PL,Fallon J,et al.Cooperation between VEGF and TNF-alpha is necessary for exposure of active tissue factor on the surface of human endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19(3):531-537.

[15]Schecter AD,Giesen PL,Taby O,et al.Tissue factor expression in human arterial smooth muscle cells.TF is present in three cellu⁃lar pools after growth factor stimulation[J].J Clin Invest,1997, 100(9):2276-2285.

[16]Wolberg AS,Monroe DM,Roberts HR,et al.Tissue factor de-en⁃cryption:ionophore treatment induces changes in tissue factor ac⁃tivity by phosphatidylserine-dependent and-independent mecha⁃nisms[J].Blood Coagul Fibrinolysis,1999,10(4):201-210.

[17]Nadir Y,Kenig Y,Drugan A,et al.,An assay to evaluate heparan⁃ase procoagulant activity[J].Thromb Res,2011,128(4):e3-8.

[18]Sørensen JV,Rahr HB,Jensen HP,et al.Markers of coagulation and fibrinolysis after fractures of the lower extremities[J].Thromb Res,1992,65(4-5):479-486.

[19]Cofrancesco E,Cortellaro M,Corradi A,et al.Coagulation activa⁃tion markers in the prediction of venous thrombosis after elective hip surgery[J].Thromb Haemost,1997,77(2):267-269.

[20]Dahl OE,Aspelin T,Arnesen H,et al.Increased activation of co⁃ agulation and formation of late deep venous thrombosis following discontinuation of thromboprophylaxis after hip replacement sur⁃gery[J].Thromb Res,1995,80(4):299-306.

[21]Siemens HJ,Brueckner S,Hagelberg S,et al.Course of molecular hemostatic markers during and after different surgical procedures [J].J Clin Anesth,1999,11(8):622-629.

[22]López Y,Páramo JA,Valentí JR,et al.Hemostatic markers in sur⁃gery:a different fibrinolytic activity may be of pathophysiological significance in orthopedic versus abdominal surgery[J].Int J Clin Lab Res,1997,27(4):233-237.

[23]Cofrancesco E,Cortellaro M,Leonardi P,et al.Markers of hemo⁃static system activation during thromboprophylaxis with recombi⁃nant hirudin in total hip replacement[J].Thromb Haemost,1996, 75(3):407-411.

[24]Ostrovsky O,Korostishevsky M,Levite I,et al.Characterization of HPSE gene single nucleotide polymorphisms in Jewish populations of Israel[J].Acta Haematol,2007,117(1):57-64.

[25]Ostrovsky O,Korostishevsky M,Levite I,et al.Association of hepa⁃ranase gene(HPSE)single nucleotide polymorphisms with hemato⁃logical malignancies[J].Leukemia,2007,21(11):2296-2303.

[26]Ralph S,Brenchley PE,Summers A,et al.Heparanase gene haplo⁃type(CGC)is associated with stage of disease in patients with ovar⁃ian carcinoma[J].Cancer Sci,2007,98(6):844-849.

（收稿：2014-12-12修回：2015-04-18）

（责任编辑孟庆才）

Changes of Plasma Heparanase Level in Patients after Hip and Knee-Replacement Surgery

REN Hai-liang,MA Xin-long,MA Jian-xiong.Postgraduate College of Tianjin Medical University,Tianjin(300070), China

ObjectiveTo analyze the plasma heparanase level and activity in patients before and after hip and knee-replacement surgery and to evaluate the relationship with postoperative hypercoagulable state. MethodsPlasma samples in 50 patients with knee osteoarthritis under knee-replacement surgery were col⁃lected preoperatively and at one hour,one week and one month postoperation.Samples were tested for heparan⁃ase levels,heparanase procoagulant activity,tissue factor activity,tissue factor/heparanase complex activity,fac⁃tor Xa and thrombin levels.ResultsHeparanase levels were significantly higher one hour and one week post-operatively compared to pre-operative levels(P＜0.05).The most dramatic changes were observed in hepa⁃ranase procoagulant activity,which reached 1.29±0.46 one hour postoperatively and 2.20±0.74 one week after surgery.Levels of factor Xa and thrombin were not significantly changed.ConclusionHeparanase pro-coagu⁃ lant activity increases one week postoperatively and remains high one month after operation.Extending prophylactic anticoagulant therapy or evaluating hepa⁃ranase procoagulant activity may potentially prevent late thrombotic events.

Heparanase;procoagulant;hip and knee-replacement surgery

R687.4

A

1007-6948(2015)03-0238-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.03.008

1.天津医科大学研究生院（天津 300070）

2.天津市天津医院（天津 300210）

马信龙，E-mail：seele124@163.com