许丽萍，孙翠云，王新允，郑海燕

检测三种转录调节因子的表达在鉴别非小细胞肺癌病理类型中的作用

许丽萍1，孙翠云2，王新允2，郑海燕1

目的：探讨肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶29(TRIM29)、p40蛋白和甲状腺转录因子-1（TTF-1）联合应用在肺鳞癌和肺腺癌鉴别诊断中的价值。方法：应用组织芯片及免疫组化EliVision法，检测35例肺鳞癌、33例肺腺癌中TRIM29、p40和TTF-1的表达以及灵敏度和特异度。结果：TRIM29、p40、TTF-1单一抗体标记，在肺鳞癌中的阳性率分别为96.97%、93.94%、6.06%，在肺腺癌中的阳性率分别为22.85%、8.57%、88.57%；联合TRIM29和p40共同标记检测在肺鳞癌中的阳性率为93.94%，在肺腺癌中共同表达的阳性率为5.71%(P＜0.001)；单一抗体检测时TRIM29和p40在肺鳞癌中的灵敏度分别是96.97%和93.94%，特异度分别是77.14%和91.43%；TTF-1在肺腺癌中的灵敏度是88.57%，特异度是93.94%；两者同时阳性的灵敏度是93.94%，特异性是94.28%。结论：TRIM29和p40两种抗体联合TTF-1检测标记肺鳞癌和肺腺癌，在鉴别诊断中具有更高的准确性。

肺癌；肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶29蛋白；p40蛋白；甲状腺转录因子-1；鉴别诊断

肺癌的组织学类型大部分是非小细胞肺癌，其中以鳞癌和腺癌为最常见。近年来，随着分子生物学的进展，分子靶向治疗药物已应用于临床，迫切要求病理医生明确区分鳞癌和腺癌。由于纤维支气管镜活检或肺穿刺活检，通常标本较小或细胞挤压，仅凭形态学诊断难以区分。TRIM29，即肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶29（tripartite motif containing 29）是TRIM蛋白家族成员之一，推测是一种转录调节因子，参与肿瘤的发生和/或分化。近年来有研究发现，TRIM29基因在NSCLC中表达有显著差异，鳞癌明显高于腺癌。p40蛋白，是p63蛋白的亚型之一，因只被p40（△Np63）识别而得名。有研究显示，在标记肺鳞癌中其特异性要优于p63蛋白。TTF-1，即甲状腺转录因子-1（thyroid transcription Factor-1），研究发现，大多数原发性和转移性的肺腺癌TTF-1阳性，而大多数肺鳞癌中则呈阴性。本研究我们利用组织芯片及EliVision免疫组化的方法联合检测TRIM29、p40和TTF-1在肺鳞癌和腺癌中的表达，探讨TRIM29、p40和TTF-1在肺鳞癌和腺癌鉴别诊断中的价值和临床意义。

1　资料和方法

1.1临床资料手术切除肺癌石蜡包埋标本68例。患者术前均未行放疗及化疗。腺癌35例，鳞癌33例。男50例，女18例；年龄51岁～76岁，中位年龄62.5岁。高-中分化41例，低-未分化27例。I～II期43例，III～IV期25例。有淋巴结转移37例，无淋巴结转移31例。收集同期尸检的10例正常肺组织作为对照组。所有标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。

1.2组织芯片的制备选取存档蜡块，HE染色切片，病理专家复诊，在相应组织点处标记。采用美国Beecher阵列仪，在受体蜡块上按阵列图打孔，组织芯直径0.6 mm。0.6 mm穿刺针将标记好的供体组织柱取出,转移到空白蜡块的相应位置,制成每个组织块直径0.6 mm、间隔0.4 mm、实际两个同心之间的距离为1.0 mm芯片蜡块。原发性肺癌和正常肺组织每例各取2芯，共计156点。采用3～4μm切片，捞片后60～62℃烤片2 h以上，组织芯均匀排布于载玻片上。无脱片，也无明显移位及扭曲。

1.3试剂及染色方法兔抗人TRIM29多克隆抗体（ZA-0497，工作液），兔抗人p40多克隆抗体（ZA-0483，工作液），鼠抗人TTF-1单克隆抗体（ZM-0270，工作液），PV-9000试剂盒（内源性过氧化物酶阻断剂、反应增强液、酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物）和DAB显色试剂盒。均购自北京中杉金桥公司。免疫组化检测采用EliVision两步法，操作严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作空白对照。

1.4结果判定标准TRIM29阳性表达定位于细胞浆/膜（见图1），p40阳性表达定位于细胞核（见图2），TTF-1阳性表达定位于细胞核（见图3）。根据免疫组化染色强度及阳性细胞数量进行半定量评分，其中染色强度以多数细胞着色深浅计算：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分；阳性细胞数＜10%为0分，10%～45%为1分，46%～65%为2分，＞65%为3分；染色强度及阳性细胞数得分相乘，0为阴性（-），1分～2分为弱阳性（+），3分～4分为阳性（++），6分以上为强阳性（+++）。

图1 肺鳞癌中TRIM29细胞浆/膜阳性表达（EliVision，×100）

图2　肺鳞癌中p40细胞核阳性表达（EliVision，×100）

图3　肺腺癌中TTF-1细胞核阳性表达（EliVision，×100）

1.5统计学处理实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计数资料使用χ2检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1TRIM29、p40和TTF-1表达TRIM29、p40和TTF-1在鳞癌中的阳性率分别为96.97%、93.94%和6.06%，在腺癌中的阳性率分别为22.85%、8.57%和88.57%（见表1）。TRIM29、p40和TTF-1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达具有组织学分型的差异，TRIM29和p40在鳞癌中的表达明显高于腺癌(P＜0.001)，TTF-1在腺癌中的表达明显高于鳞癌，差异具有统计学意义(P＜0.001)。

2.2TRIM29和p40共同表达TRIM29和p40在鳞癌中共同表达的阳性率为（31/33）93.94%，在腺癌中共同表达的阳性率为（2/35）5.71%（P＜0.001）。

2.3灵敏度和特异度单一抗体检测时，TRIM29和p40在肺鳞癌中的灵敏度分别是96.97%和93.94%，特异度分别是77.14%和91.43%；TTF-1在肺腺癌中的灵敏度是88.57%，特异度是93.94%；TRIM29和p40联合检测在肺鳞癌中任一阳性的灵敏度是96.97%，特异性是74.29%；两者同时阳性的灵敏度是93.94%，特异性是94.28%（见表2）。对TRIM29和p40同时阳性表达、TTF-1阴性表达的肺鳞癌进行检测，肺鳞癌的灵敏度为93.94%，特异度为97.14%；同时对TRIM29和p40同时阴性表达，TTF-1阳性表达的肺腺癌病例进行检测，其腺癌的灵敏度为88.57%，特异度为100%(见表3)。

表1　TIRIM29、p40和TTF-1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况

表2　TIRIM29、p40和TTF-1在肺鳞癌和肺腺癌中灵敏度及特异度比较（%）

表3　联合TRIM29和p40、TTF-1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达

3　讨论

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发展快、死亡率高，其中非小细胞癌占80%以上。目前肺癌的WHO分类主要建立在HE形态的基础上，然而在日常工作中活检小标本样本量少或在取材过程中受到人为原因等，造成镜下HE形态无法正确分辨其组织学类型。又因该肿瘤在细胞学、组织学、免疫表型及分子遗传学水平的异质性，因此通过抗体标记明确其组织学类型被广泛应用。近年来已推出的联合抗体标记非小细胞肺癌，只有75%的病例得以正确分类[1]，寻找新的指标来标记该肿瘤显得尤为重要。

TRIM29蛋白属于TRIM蛋白家族成员，基因定位于11q23，具有TRIM家族所特有的保守结构特征，可能是一种转录调节因子[2]。已有文献报道，TRIM29在胰腺癌[3]、胃癌[4]、结肠癌[5]、宫颈癌[6]、膀胱癌[7]等的肿瘤中过表达，但很少用于肺癌的研究。近年Ring等[8]通过应用免疫组织化学的方法研究发现，TRIM29基因在NSCLC不同组织学类型中表达有显著差异，鳞癌明显高于腺癌。我们的研究结果显示，TRIM29在肺鳞癌和腺癌中表达也有显著性差异，并且对肺鳞癌有高度的敏感性（96.97%）和特异性（77.14%），与文献报道一致。在肺鳞癌和肺腺癌的鉴别诊断中具有一定的实用价值。

p40蛋白是p63基因的亚型之一，文献报道主要应用于食管癌、头颈部癌等方面的研究。近年来，有学者将p40用于肺组织的研究发现，在正常的肺组织中p40蛋白表达于支气管黏膜基底细胞及支气管腺体的肌上皮细胞[9]。国外一些实验室将p40用于肺鳞癌和肺腺癌的鉴别诊断，研究结果表明，p40对肺鳞癌具有较高的敏感性和特异性[10-11]。Righi等[12]的研究结果表明，p40在肺鳞癌中高表达。Bishop等[13]在一项研究中表明，p40在肺鳞癌中的阳性率达到100%。Nonaka[14]的研究结果表明，在150例肺腺癌病例中p40均不表达。我们通过本研究显示，p40在肺鳞癌中具有高度的敏感性（93.94%）和特异性（91.43%），与文献报道相符。

TTF-1即甲状腺转录因子-1，主要表达于甲状腺肿瘤及肺肿瘤。TTF-1对肺腺癌具有较高的敏感性和特异性[15-16]。我们研究的结果为TTF-1在肺腺癌中的敏感度为88.57%，特异性为93.94%，支持这一观点。尤其对低分化肺鳞癌和低分化肺腺癌，在支气管镜活检和针吸活检中更具有优势。因为TTF-1是细胞核着色，在组织挤压的情况下更易分辨。

通过本组实验结果显示，在单一抗体检测中，TRIM29和p40在肺鳞癌中的阳性率分别是96.97%和93.94%，在肺腺癌中的阳性率分别是22.85%和8.57%，而且有97%的病例达3分以上。我们还将TRIM29和p40联合标记肺鳞癌和肺腺癌，其阳性率分别为93.94%和5.71%。在灵敏度和特异度检测中，我们还发现，在肺鳞癌中联合标记TRIM29和p40其特异性更高于单一抗体标记。同时，我们联合TTF-1检测时显示，TTF-1在肺腺癌中的阳性率为88.57%，肺鳞癌中的阳性率为6.06%，其对肺腺癌更具有高度的特异性（93.94%）。研究结果表明，联合使用TRIM29、p40和TTF-1标记肺鳞癌和肺腺癌，其特异度要高于单一抗体标记。

TRIM29和p40在肺鳞癌中具有高度的灵敏度和特异度，两种抗体在肺鳞癌中的特异性更高。两种抗体联合标记TTF-1检测肺鳞癌和肺腺癌，在鉴别诊断中具有更高的准确性，为临床分子靶向治疗，对个体化治疗方案提供了重要的依据。因此，TRIM29、p40和TTF-1蛋白联合检测，在肺癌的诊断及临床治疗的指导上具有一定的实用价值。

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（收稿：2015-02-06修回：2015-04-26）

（责任编辑李志刚屈振亮）

Detecting the Role of the Expression of Three Transcriptional Regulation Factors in Identifying the Pathological Types of Non-small Cell Lung Cancer

XU Li-ping,SUN Cui-yun,WANG Xin-yun,et al. Department of Pathology,Second Hospital Affiliated to Tianjin Medical UniverSity,Tianjin(300211),China

objectiveTo investigate the value of combined application of TRIM29,p40 and TTF-1 in the differential diagnosis between lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma.MethodsThe expres⁃sions of TRIM29,p40 and TTF-1 protein were detected in 35 cases of lung squamous cell carcinoma and 33 cas⁃es of lung adenocarcinoma using tissue microarray and immunohistochemical method.The sensitivity and speci⁃ficity were calculated in diagnosis.The statistical analysis was performed using SPSS 17.0 software(SPSS,Inc., Chicago,IL,USA).χ2test was applied to compare the numerical data among groups.P＜0.05 was considered to indicate a statistically significant result.ResultsThe positive rates of TRIM29,p40 and TTF-1 protein ex⁃pression in lung squamous cell carcinoma were 96.97%,93.94%and 6.06%,respectively.And the positive rates of TRIM29,p40 and TTF-1 protein expression in lung adenocarcinoma were 22.85%,8.57%and 88.57%,re⁃spectively.When combined application of TRIM29 and p40 in lung cancer,the rates were 93.94%in squamous cell carcinoma and 5.71%in adenocarcinoma.Therefore the curative effect of combined application of TRIM29 and p40 in lung cancer was better than application of anyone alone(P＜0.001).Applicating TRIM29 or p40 in lung squamous cell carcinoma,the sensitivity was 96.97%and 93.94%,and specificity was 77.14%and 91.43%.Applicating TTF-1 in lung adenocarcinoma,sensitivity was 93.94%,and specificity was94.28%. ConclusionUsing TRIM29 or p40 combined with TTF-1 in differential diagnosis between lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma was useful in lung cancer diagnosis and clinic treatment guidance.

Lung tumor;tripartite motif containing 29;p40;TTF-1;differential diagnosis

R734.2

A

1007-6948(2015)03-0227-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.03.005

1.天津医科大学第二医院病理科（天津 300211）

2.天津医科大学总医院病理科（天津 300070）

郑海燕，E-mail：zhhy_ydey@163.com.